인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

요약

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

초록

생체의 입양 전송 전이성 흑색 종 환자의 상당한 부분 집합의 내구성과 완전한 응답을 중재 할 수자가 종양 침윤 림프구 (TILS)을 확장했다. 이 접근법의 주요 장애물 텔로미어 단축에 의한 전사 T 세포의 감소 된 가능성, 그리고 TILS의 제한된 수의 환자로부터 얻은. 그러나, 이들 덜 분화 된 T 세포의 다수 발생하는 문제이다 텔로미어 길이 덜 분화 된 T 세포는 T 세포 대체 요법을위한 이상적인 T 세포의 서브 세트 일 것이다. 대체 T 세포 요법이 제한 이론적하여 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에 의해 극복 될 수있는 자기 갱신 능성, 길쭉한 텔로미어를 유지 및 면역 요법자가 T 세포의 무제한 소스를 제공한다. 여기서는 TILS로 프로그래밍 인자의 형질 센다이 바이러스 벡터를 사용 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 생성완전히 재 프로그래밍, 벡터없는 클론이야. 이러한 TIL 유래 iPSCs는 T 세포 대체 요법에 대한 환자 - 덜 분화 된 종양 특이 적 T 세포를 생성 할 수있을 것이다.

서문

전사 인자의 정의 된 설정의 과발현을 통해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 생성을 허용 세포 리 프로그래밍 기술은 세포 기반 치료 ^1,2- 분야에서 큰 가능성을 보유하고있다. 이러한 iPSCs는 전사와 후생 유전 학적 특징을 나타내는 유사 배아 줄기 세포 (는 ESC) ^3-5 자기 갱신과 다 능성에 대한 용량을 가지고있다. 지난 10 년 동안 프로그래밍 기술로 만든 놀라운 진보는 우리가 심지어 T 세포 ^6-8으로 말기 분화 세포에서 인간 iPSCs를 생성 할 수있다. T 세포 유래 iPSCs는 (TiPSCs)는 TiPSCs ^9-11에서 항원 특이 적 T 세포의 재생을 허용하는 원 T 세포와 같은 T 세포 수용체 (TCR) 쇄 유전자의 동일한 재 배열 된 구성을 유지한다.

흑색 침윤 림프구의 약 80 % (TILS)이 환자의 종양 특이 적 종양 관련 항원 A를 인식 얻은차 원래 암세포 ^(12)에 대한 세포 독성을 유지한다. 특히 TILS에 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1)의 발현은 돌연변이 neoantigen 특정 CD8 ⁺ 림프구 ^(13)을 포함한자가 종양 반응성 레퍼토리를 식별하는 것으로 밝혀졌다. 예비 lymphodepleting 요법 및 인터루킨 -2 (IL-2)의 전신 투여와 함께 전 생체 확장자가 TILS의 입양 전송 환자 ^(14)의 하위 집합에서 전이성 흑색 종의 실질적인 회귀가 발생할 수 있습니다. 전임상 모델에서 환자의 결과를 유도에도 불구하고, 불량한 주입 된 T 세포의 생존과 면역 억제 경로의 존재는 T 세포 대체 치료 잠재력을 손상시킬 것으로 보인다. 현재 임상 프로토콜은 다수 얻기 위해자가 T 세포의 광범위한 생체 조작을 필요로한다. 이것은 생존율이 불량한 말단 분화 된 T 세포를 감소 prol의 발생을 초래iferative 용량, PD-1 ^(15)의 높은 수준.

대체 T 세포 요법이 이론적 한계에 대한자가 면역 T 세포의 무제한 소스를 제공 할 수 iPSCs를 사용함으로써 극복 될 수있다. 최근 센다이 바이러스 (SEV) 네 개의 전사 인자 - 매개 전달, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC ^{× 16} PD-1의 높은 발현 수준을 흑색 TILS의 프로그래밍을보고 하였다. 레트로 바이러스 벡터가 재 프로그래밍 유전자를 표현하기 위해 호스트 염색체에 통합을 필요로하지만, SEV 벡터가 아닌 통합하고 결국 세포질에서 제거된다. 효율성을 재 프로그래밍하는 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 비해 ^6-8 SEV 시스템 훨씬 높다. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 의해 생성 된 일부 IPSC 클론 nonlymphoid 계통 ^6-8에서 할 수 있지만 또한 SEV 특히, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서의 T 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기, 우리는 세부 사항절차는 인간 흑색 종 TILS의 단리 및 활성화와 SEV 리 프로그래밍 시스템을 사용 TIL 유래 iPSCs의 발생 구현.

프로토콜

참고 : 환자는 셀위원회가 연구를 승인 줄기 임상 시험 심사위원회와 인간 다 능성에 참여하는 동의를 제공해야합니다.

1. 분리 및 TILS의 문화

1. 병리 서비스 / 조직 조달 코어에서 병리 조직 학적 진단을 위해 필요하지 않습니다 종양 물질을 얻습니다. 30 ml의 종양 수집 미디어 (표 1)과 50 ml의 튜브에 종양 표본의 20-100g를 놓습니다.
2. 고체, 회사, 가위를 사용하여 깨지기 쉬운 및 / 또는 피 묻은 괴사 지역에서 종양 표본의 정상 조직을 해부하다. 괴사 조직을 제거한 후 가능한 한 작게 시편을 말하다하기 위해 가위를 사용합니다.
3. 제조자의 지시에 따라 dissociator 종양 분리 키트 (인간)를 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 다진 표본. 50 ML 튜브에 설정되어있는 70 μm의 셀 스트레이너와 서스펜션 필터와 함께 스트레이너을 2 회 반복한다RPMI 1640 2 ㎖.
4. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 T 세포 배지 (표 1) 10ml에 세포를 재현 탁.
5. 예컨대 피콜 100 % 구배 용액 10 ㎖의 하부 단계 및 둘 베코 인산염으로 희석하고 75 % 구배 용액 30 ㎖의 중간 단계로 50 ㎖의 튜브 (구배 용액)으로 두 단계 구배 용액을 준비 완충 식염수, 아니 칼슘, 아니 마그네슘 (D-PBS (-)).
6. (단계 1.5) 구배 용액에 (단계 140에서) 세포 현탁액 층을 포함한다. 45 분 동안 20 ° C에서 400 XG에 원심 분리기.
7. 100 % 구배 용액 및 50 ㎖ 튜브에서 75 % 구배 용액의 계면에서 농축 TILS을 함유하는 층을 수집한다. D-PBS 중 20 ~ 30 ml를 첨가하여 농축 TILS와 용액의 희석 층 (-).
8. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 10 ml의에 TIL 풍부한 부분을 재현 탁T 세포 매체.
9. 배양 37 ° C에서 6 웰 플레이트에 2 T 세포 배지 ㎖의 6000 IU / ml의 재조합 인간 (RH) IL-2로한다 (단계 1.8)에서 분획, 5 % CO _2.
10. 배양 개시 후 5 일에 절반 미디어를 변경 한 후 2-3 일마다.
11. 1의 비율로 세포 분열 2 : 트립신없이 부드럽게 80~90%에 포화 상태에 도달 할 때 우물의 수를 두배로 현탁 한 후. 6000 IU / ml의 신선한 T 세포 매체와 rhIL-2의 절반 량 (1ml)에 추가한다.

마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 셀 플레이트 2. 준비

1. 80-90% 합류 (3-4 × ¹⁰⁶ 세포)까지 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 SNL 피더 세포 배지 (표 1) 10ml에 문화 SNL 피더 세포로 진행한다.
2. 직접 SNL 피더 세포 배양 접시에 0.4 ㎎ / ㎖ 마이 토마 이신 C 용액 310 μl를 추가하고 37 ° C 2 시간 15 분, 5 % CO ₂ 부화. 미디어 a를 대기음ND 5ml를 D-PBS로 두 번 세포를 씻어 (-).
3. 0.5 ml의 0.25 % 트립신 / 1mM의 EDTA를 첨가하고 세포를 해리 1 분 동안 실온에서 배양한다. 중화 SNL 피더 세포 미디어 4.5 ML을 추가하고 하나의 현탁액에 세포를 재 - 일시 중지합니다.
4. 5 분 동안 200 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 세포를 전송합니다. 미디어 대기음 SNL 피더 세포 배지 10ml에 다시 현탁 한 후 혈구 세포 계산.
5. 플레이트 1.5 × 10 ⁶ 10cm 접시에 SNL 피더 세포의 웰 당 세포와 37 ° C에서 품어, 5 % CO _2. 삼일 이내에 SNL 피더 세포를 사용합니다.

센다이 바이러스를 사용하여 iPSCs의 3 세대 (SEV) 벡터

1. 수확 TILS 및 플레이트 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / ㎖) TILS 5 × ¹⁰⁵ 세포를 활성화하고 수용성 마우스 항 - 인간 CD28 (/ ㎖ 5 μg의) (단계 1.11)에서, rhIL-2 세에서 6 웰 플레이트에서 T 세포 배지 2 ㎖에 (6000 IU / ㎖)7 ° C를 5 일 동안 5 % CO _2.
2. 피펫을 사용하여 15 ml의 튜브 (단계 3.1)을 TILS를 수확하고, 혈구와 세포 수를 계산합니다.
3. 500 μL의 rhIL-2 1 판 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / mL)로 TILS의 X ¹⁰⁵ 세포 및 가용성 마우스 항 - 인간 CD28 (5 μg의 / ㎖) (60 IU / ㎖) 활성화 37 ° C에서 24 웰 플레이트에 웰 당 프로그래밍 미디어 (표 1), 24 시간 동안 5 % CO _2의. SEV 감염에 대한 3 우물을 준비합니다 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC (1도) SEV 감염 (GFP : 녹색 형광 단백질) (1도) 세포 수 (1 웰).
4. (단계 3.3에서) 24 시간 후, 혈구와 세포 수를 계산하고 감염의 다양한 (3-20) 다중도 (MOI) 각 바이러스의 양을 결정합니다. -80 ° C 저장 영역에서 센다이 바이러스 벡터 튜브 한 세트를 제거합니다. 수조 (37 ° C)에서 신속하게 SEV 벡터를 해동하고 얼음에 배치합니다.
   바이러스의 양 (μL)= MOI (CIU / 셀) 바이러스 / 역가 세포의 X 번호 (CIU / ㎖) × 10-3 (μL / ㎖)
5. 활성화 TILS 포함 매체로 10-20 MOI에서 SEV 벡터의 혼합물을 첨가하여 개별적 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC을 수행 네 센다이 바이러스 벡터 튜브의 각각의 계산 된 양을 추가한다.
6. 형질 도입 효율을 확인하려면 활성화 TILS의 우물에 SEV-GFP의 계산 된 볼륨을 추가합니다.
7. (단계 3.5에서 3.6 단계) 접시를 놓고 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO _2의 인큐베이터에서. 24 시간 후, 형광 현미경 하에서 SEV-GFP 감염 TILS를 사용하여 감염 효율을 추정한다.
8. 15 ML 튜브에 (단계 3.5에서) 세포를 수집합니다. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기.
9. 상층 액을 제거하고 영장류 ES 세포 매체와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 hESC의 미디어 0.5 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
10. 접점 10cm의 접시에 현탁액을 전송인 hESC의 배지 10ml에 SNL 피더 세포 미토 마이신 C는 처리. 식민지가 성장 될 때까지 다른 모든 날 hESC의 미디어를 변경합니다.
11. 21 일 (18)의 주위에, 클린 벤치에서 10 μl의 팁을 사용하여 현미경으로 식민지 주위 SNL 피더 세포를 제거합니다.
12. 10 μl의 팁을 사용하여 콜로니를 긁어 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰 당 iPSCs 배지 100 ㎕에 200 ㎕의 팁을 사용하여 전송. 피펫 최대 2-3 시간에 아래로 50 ~ 100 μm의 평균 크기가 작은 덩어리로 식민지를 중단합니다.
13. 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 iPSCs 매체의 웰 당 2 ㎖ 중의 (단계 2)에서 미토 마이신 C 처리 SNL 피더 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에 작은 덩어리로 이동. 매일 iPSCs 미디어를 변경합니다.
14. 모든 5~6일 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 신선한 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 세포와 6 잘 조직 배양 플레이트에 iPSCs를 전송합니다. immun 각 클론의 접시 당 2 우물을 준비ostaining.
15. 만능 마커 (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 OCT3 / 4) ⁽¹⁾ 면역 조직 화학 염색을하여 각 클론의 전체 재 프로그래밍을 결정합니다.
    참고 : 만능 잠재력의 추가 평가를 위해 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인이 배아 체 형성과 분화 분석 또는 기형 종 형성 분석 ^(16)에 의해 삼 배엽으로 분화 할 수 있는지 확인합니다.
16. 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인은 세포 유전 학적 분석에 의해 정상 핵형을 보여 있는지 확인합니다.
17. 기형 종 형성, 미분화 TIL 유래 IPSC DMEM 6-8 주령 암컷 NOD / SCID 마우스의 피하 조직에 10 % FCS를 함유하는 100 ㎕ (1 × ¹⁰⁶⁾ 현탁액을 주입. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 기형 종 섹션.

SSEA3, SSEA4, TRA1-60 및 TRA1-81에 대한 iPSCs 4. 면역 형광 염색법

1. 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 및 4 % PA 1 mL로 iPSCs 해결10 분 동안 raformaldehyde 솔루션입니다. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회 1 mL로 iPSCs 씻는다.
   참고 :이 독성이 있기 때문에 파라 포름 알데히드를 사용하는 경우주의해야합니다.
2. 30 분 동안 버퍼 (표 1)과 차단 iPSCs를 전처리. 한편, PBS 및 트리톤 희석 차 항체 (래트 항 - 인간 SSEA3 마우스 항 - 인간 SSEA4 마우스 항 - 인간 TRA1-60, 마우스 항 인간 TRA1-81) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액 -100 (총 용적 1 ㎖).
3. 차단 버퍼 (표 1)를 제거합니다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 한편, 이차 항체 (항 - 마우스 IgG를 및 IgM의 또는 항 래트 IgM의) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액.
4. 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 1 ml의 PBS 3 회, 각과 iPSCs를 씻는다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 암실에서 실온에서 45 분 동안 배양한다.
5. 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경으로 iPSCs을 준수하십시오.

Oct3에 대한 iPSCs 5. 면역 형광 염색 / 4

1. 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 10 분간 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 1 mL로 iPSCs 해결. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회와 iPSCs를 씻는다.
2. permeabilization 완충액 (표 1)를 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 버퍼 (표 1) 차단 추가합니다.
3. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 한편, 버퍼를 차단의 기본 항체 (마우스 항 - 인간 Oct3 / 4) 1:50 희석.
4. 희석 차 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C에서 품어.
5. 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 1ml를 3 회 각을 iPSCs를 씻는다. 한편, 디(항 - 마우스 IgG / IgM의 염소) 류트 이차 항체 1 : 100 버퍼를 차단한다.
6. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 45 분 동안 암실에서 실온에서 배양한다.
7. 희석 보조 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경에서 iPSCs을 준수하십시오.

결과

그림 1은 항 CD3 / CD28와 활성화 및 TILS에 OCT3 / 4, KLF4, SOX2 및 c-MYC의 유전자 전달 뒤에 rhIL-2 흑색 종 TILS의 초기 확장을 포함하는 절차의 개요를 보여줍니다 iPSCs의 생성. 일반적으로, rhIL-2 시작과 문화에 TILS는 구체에게 문화의 개시 후 21-28일을 형성한다. 이 시점에서, TILS는 항 CD3 활성화 될 준비가되어 / CD28가. 그림 2A 문화에 TILS은 rhIL-2 21 일에, 활성...

토론

여기, 우리는 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 네 개의 전사의 SEV 매개 형질 도입에 의해 iPSCs에 흑색 종 TILS를 재 프로그래밍하기위한 프로토콜 요인 보여 주었다. 이 방법은 T 세포를 재 프로그램하는 SEV 시스템을 사용하여, 비 - 통합 방식 ^(7)의 이점을 제공한다.

이전의 연구는 SEV 리 프로그래밍 시스템은 섬유 모세포뿐만 아니라 말초 혈액 T 세포 ^7,17뿐만 아니라 재...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264