Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Résumé

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Résumé

Le transfert adoptif de lymphocytes ex vivo élargi infiltrant les tumeurs autologues (TIL) peut servir de médiateur des réponses durables et complets dans des sous - ensembles importants de patients atteints de mélanome métastatique. Les principaux obstacles de cette approche sont la viabilité réduite des cellules T transférées, causées par le raccourcissement des télomères, et le nombre limité de TIL obtenus à partir de patients. des cellules T différenciées avec moins longs télomères serait un sous-ensemble de cellules T idéal pour une thérapie adoptive des lymphocytes T, mais, en générant un grand nombre de ces cellules T différenciées moins est problématique. Cette limitation de la thérapie adoptive de cellules T peut être théoriquement surmonté en utilisant des cellules souches pluripotentes induites (CISP) que l'auto-renouvellement, maintenir télomères pluripotence, ont allongées, et de fournir une source illimitée de cellules T autologues pour l'immunothérapie. Ici, nous présentons un protocole pour générer CSPi en utilisant des vecteurs de virus Sendai pour la transduction des facteurs de reprogrammation en TIL. Ce protocole génèrents entièrement reprogrammées, clones sans vecteur. Ces CSPi TIL dérivés pourraient être en mesure de générer des cellules T patient et spécifiques de tumeurs moins différenciées pour la thérapie adoptive de cellules T.

Introduction

La technologie de reprogrammation cellulaire qui permet la génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP) via la surexpression d'un ensemble défini de facteurs de transcription est très prometteuse dans le domaine des thérapies cellulaires ^1,2. Ces CSPi présentent des caractéristiques de transcription et épigénétiques et ont la capacité d'auto-renouvellement et la pluripotence, de manière similaire à des cellules souches embryonnaires (CSE) ^3-5. Des progrès remarquables réalisés dans la technologie de reprogrammation au cours de la dernière décennie nous a permis de générer des CSPi humaines , même à partir de cellules différenciées, telles que les cellules T ^6-8. T iPSCs dérivées de cellules (TiPSCs) conservent la même configuration réarrangé de récepteur des cellules T (TCR) des gènes de chaîne comme les cellules T d' origine, ce qui permet la régénération des cellules T spécifiques d'antigène à partir TiPSCs ^11/09.

Près de 80% des lymphocytes infiltrant de mélanome (TILs) obtenu à partir de la tumeur d'un patient à reconnaître spécifiquement des antigènes associés à une tumeur d'unnd maintenir cytotoxicité contre les cellules cancéreuses d' origine ^12. En particulier, l'expression de la mort cellulaire programmée protein-1 (PD-1) sur des TIL a été trouvée pour identifier le répertoire de tumeur autologue réactif, notamment muté lymphocytes CD8 ^{+ 13} spécifiques à néoantigène. Le transfert adoptif de l' ex-vivo de TIL autologues expansées en combinaison avec les schémas de préparation et lymphodepleting administration systémique de l' Interleukine-2 (IL-2) peut provoquer une régression substantielle du mélanome métastatique dans les sous - ensembles de patients ^14. Malgré des résultats encourageants dans des modèles précliniques et chez les patients, une mauvaise survie des cellules T infusées et l'existence de voies immunosuppresseurs semblent compromettre le plein potentiel de la thérapie adoptive de cellules T. Les protocoles cliniques actuels exigent beaucoup de manipulation ex vivo de cellules T autologues afin d'obtenir un grand nombre. Cela se traduit par la génération de cellules différenciées T qui ont une faible survie, prol réduitela capacité iferative et des niveaux élevés de PD-1 ^15.

Cette limitation de la thérapie adoptive de cellules T peut être théoriquement surmonté en utilisant CSPi qui peuvent fournir une source illimitée de cellules T autologues pour l'immunothérapie. Nous avons récemment rapporté la reprogrammation du mélanome TIL exprimant des taux élevés de PD-1 par le virus Sendai (SeV) de transduction médiée des quatre facteurs de transcription, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-myc ^16. Bien que des vecteurs rétroviraux nécessitent l'intégration dans les chromosomes de l'hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation, vecteurs SeV sont non-intégration et sont finalement éliminés du cytoplasme. Reprogrammant l' efficacité est beaucoup plus élevé avec un système de SeV par rapport aux vecteurs de lentivirus ou retrovirus ^6-8. En outre, en particulier SeV peut reprogrammer les cellules T dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP), tandis que certains clones générés par iPSC lentivirus ou des vecteurs rétroviraux peuvent provenir de lignées non lymphoïdes ^6-8. Ici, nous détaillonsles procédures mises en œuvre pour l'isolement et l'activation du mélanome humain TIL et pour la génération de CSPi TIL dérivées en utilisant un système de reprogrammation SeV.

Protocole

NOTE: Les patients doivent donner un consentement éclairé à participer à la commission d'examen institutionnel et souches pluripotentes humaines Comité cellulaire approuvé l'étude.

1. Isolement et culture de TIL

1. Obtenir matériel tumoral qui ne sont pas requis pour le diagnostic histopathologique du noyau d'approvisionnement service de pathologie / tissu. Placer 20-100 g d'échantillons de tumeur dans un tube de 50 ml avec 30 ml de milieu de tumeur collecte (tableau 1).
2. Disséquer solide, ferme, tissu normal de l'échantillon de tumeur des zones nécrotiques fragiles et / ou sanglantes avec des ciseaux. Après avoir retiré le tissu nécrotique, utiliser les ciseaux pour hacher l'échantillon aussi petit que possible.
3. Dissocier le spécimen émincés dans une suspension à cellule unique en utilisant un kit de dissociation dissociateur et de la tumeur (humaine) selon les instructions du fabricant. On filtre la suspension avec un tamis cellulaire de 70 pm qui est fixé sur un tube de 50 ml et on lave le filtre avec 2 fois2 ml de RPMI 1640.
4. Centrifuger à 200 xg à la température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de lymphocytes T (Tableau 1).
5. Préparer une solution à gradient en deux étapes tel que Ficoll (solution de gradient) dans un tube de 50 ml, avec une étape inférieure de 10 ml d'une solution à gradient de 100% et une étape intermédiaire de 30 ml d'une solution à gradient de 75% dilué avec un phosphate de Dulbecco une solution saline tamponnée, pas de calcium, pas de magnésium (D-PBS (-)).
6. La couche de la suspension cellulaire (étape 1.4) sur la solution à gradient (étape 1.5). Centrifuger à 400 g à 20 ° C pendant 45 min.
7. Recueillir la couche contenant les TIL enrichi à l'interface entre la solution de gradient de 100% et la solution de gradient de 75% dans un tube de 50 ml. Diluer la couche de la solution avec les TIL enrichie par l'addition de 20 à 30 ml de D-PBS (-).
8. Centrifuger à 200 xg à la température ambiante pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la fraction TIL enrichi dans 10 mldes médias de cellules T.
9. La culture de la fraction (étape 1.8) avec 2 ml de milieu de lymphocytes T et 6000 UI / ml humaine recombinante (rh) de l' IL-2 dans une plaque à 6 puits à 37 ° C, 5% de CO _2.
10. Changer la moitié des médias le jour 5 après initiation de la culture et tous les 2-3 jours par la suite.
11. Fractionner les cellules à un rapport de 1: 2 sans trypsination après avoir suspendu doucement, en doublant le nombre de puits en atteignant 80-90% de confluence. Ajouter un demi-volume (1 ml) de milieu de lymphocytes T frais et de rhIL-2 à 6000 UI / ml.

2. Préparation de la mitomycine-C-traitée SNL Feeder cellulaire Plate

1. La culture des cellules nourricières SNL dans 10 ml de SNL support de cellules nourricières (tableau 1) avec une gélatine revêtues de 10 cm à 0,1% jusqu'à ce que 80-90% de la confluence (3-4 x 10 ⁶ cellules) est atteinte.
2. Ajouter 310 pi de 0,4 mg ml de solution / mitomycine C directement dans la boîte de culture cellulaire SNL d'alimentation et incuber à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 2 h et 15 min. Aspirer les médias unend laver les cellules deux fois avec 5 ml de D-PBS (-).
3. Ajouter 0,5 ml de trypsine à 0,25% / EDTA 1 mM et on incube à température ambiante pendant 1 min pour dissocier les cellules. Ajouter 4,5 ml de SNL médias de cellules nourricières pour neutraliser et remettre en suspension les cellules dans une seule suspension.
4. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml et on centrifuge à 200 g pendant 5 min. Aspirer les médias et compter les cellules avec un hémocytomètre après remise en suspension dans 10 ml de SNL médias de cellules nourricières.
5. Plaque de 1,5 x 10 ⁶ cellules par puits des cellules nourricières SNL sur un plat de 10 cm et on incube à 37 ° C, 5% de CO _2. Utiliser les cellules nourricières SNL dans les 3 jours.

3. Génération de CSPi utilisant le virus Sendai (SeV) Vecteur

1. Récolter les TIL (étape 1.11) et activer 5 x 10 ⁵ cellules de TIL avec des souris de type plaque liée CD3 anti-humain (1 ug / ml) et de la souris soluble CD28 anti-humain (5 pg / ml), avec de la rhIL-2 (6000 IU / ml) dans 2 ml de milieu de lymphocytes T dans une plaque à 6 puits à raison de 37 ° C, 5% CO ₂ pendant 5 jours.
2. Récolter les TIL (étape 3.1) dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
3. Réactiver 1 x 10 ⁵ cellules de TIL avec des souris de type plaque liée CD3 anti-humain (1 ug / ml) et soluble de souris CD28 anti-humain (5 pg / ml), avec de la rhIL-2 (60 UI / ml) dans 500 ul des supports de reprogrammation (tableau 1) par puits dans une plaque à 24 puits à 37 ° C, 5% de _CO2 pendant 24 heures. Préparer 3 puits pour l'infection SeV: OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC (1 puits); infection SeV (GFP: protéine fluorescente verte) (1 puits); et le nombre de cellules (1 puits).
4. Après 24 heures (de l'étape 3.3), compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre et déterminer le volume de chaque virus pour diverses (3-20) multiplicités d'infection (MOI). Retirer un ensemble de tubes de vecteur de virus Sendai de -80 ° C stockage. Décongeler les vecteurs SeV rapidement dans un bain d'eau (37 ° C) et placez-les sur la glace.
   Volume de virus (ul)= MOI (CIU / cellule) x nombre de cellules / titre du virus (CIU / ml) x 10-3 (pl / ml)
5. Ajouter les volumes calculés de chacun des quatre tubes de Sendai vecteur viral qui a effectué individuellement OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-myc en ajoutant un mélange de vecteurs de SeV à 10-20 MOI dans les milieux, y compris TIL activés.
6. Pour déterminer l'efficacité de transduction, ajouter les volumes calculés de SeV-GFP dans un puits de TIL activés.
7. Placer le plat (de l' étape 3.5 et l' étape 3.6) dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 24 heures. Au bout de 24 h, estimer l'efficacité de l'infection en utilisant des TIL infectées par le SeV-GFP au microscope à fluorescence.
8. Recueillir les cellules (de l'étape 3.5) dans un tube de 15 ml. Centrifuger à 200 xg à la température ambiante pendant 5 min.
9. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 0,5 ml de milieu CSEh avec Primate ES cellulaire moyen et le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, 4 ng / ml).
10. Transférer la suspension dans un plat de 10 cm que Contains mitomycine-C-traité des cellules nourricières SNL dans 10 ml de CSEh médias. Changer les médias CSEh tous les jours jusqu'à ce que les colonies sont cultivées.
11. Autour de jour 18 à 21, enlever les cellules nourricières SNL autour des colonies au microscope en utilisant une pointe de 10 pi dans le banc propre.
12. Grattez les colonies en utilisant une pointe de 10 pi et de les transférer à l'aide d'une pointe de 200 pi dans 100 pi de CSPi médias par puits d'une plaque de culture tissulaire de 96 puits. La pipette vers le haut et vers le bas à 2-3 fois pour briser les colonies en petits amas ayant une taille moyenne de 50 à 100 um.
13. Transférer les petites touffes dans 6 puits des plaques de culture tissulaire avec des cellules nourricières SNL mitomycine-C-traités (de l'étape 2) dans 2 ml par puits de iPSCs support avec le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, 4 ng / ml). Changer les médias CISP chaque jour.
14. Transférer les iPSCs à 6 puits des plaques de culture tissulaire avec des cellules nourricières SNL mitomycine-C frais traités avec 1 mg / ml de collagénase IV, tous les 5-6 jours. Préparer 2 puits par plaques de chaque clone pour immunostaining.
15. Déterminer la pleine reprogrammation de chaque clone par coloration immunohistochimique de marqueurs de pluripotence (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 et OCT3 / 4) ^1.
    NOTE: Pour plus d' évaluation du potentiel de pluripotence, confirment que les lignes iPSC entièrement reprogrammées peuvent se différencier en trois couches germinales par une formation de corps embryoïdes et le dosage de différenciation ou d' un essai de formation de tératome ^16.
16. Vérifiez que les lignes iPSC entièrement reprogrammées démontrent un caryotype normal par analyse cytogénétique.
17. Pour la formation de tératome, injecter un indifférenciée COPSi TIL dérivé (1 x 10 ⁶⁾ en suspension dans 100 pi de DMEM contenant 10% de FCS dans le tissu sous - cutané des souris âgées de souris NOD / SCID femelles de 6 à 8 semaines. sections de tératome Stain avec hématoxyline et éosine.

4. immunofluorescence des CSPi pour SSEA3, SSEA4, TRA1-60 et TRA1-81

1. Laver CSPi avec 1 ml de PBS et fixer les CSPi avec 1 ml de 4% par anraformaldehyde solution pendant 10 min. Retirer la solution de paraformaldéhyde 4% et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois.
   NOTE: Soyez prudent lorsque vous utilisez paraformaldehyde car il est toxique.
2. Prétraiter les CSPi avec un tampon de blocage (tableau 1) pendant 30 min. Pendant ce temps, diluer les anticorps primaires (rat anti-humain SSEA3, souris anti-humain SSEA4, souris anti-humaine TRA1-60, et la souris TRA1-81 anti-humain) solution de sérum de chèvre à 1:50 dans 1,5% dilué avec du PBS et TritonX -100 (volume total: 1 ml).
3. Éliminer le tampon de blocage (tableau 1). Ajouter la solution d'anticorps primaire dilué et on incube pendant 1 heure à température ambiante. Pendant ce temps, diluer l'anticorps secondaire (IgG anti-souris et IgM ou anti-rat IgM) à 1:50 dans 1,5% de solution de sérum de chèvre.
4. Retirer la solution d'anticorps primaire dilué et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Ajouter la solution d'anticorps secondaire dilué et on incube pendant 45 min à température ambiante dans une pièce sombre.
5. Retirer la solution d'anticorps secondaire dilué et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Observer les CSPi avec microscopie immunofluorescence.

5. immunofluorescence des CSPi pour Oct3 / 4

1. Laver CSPi avec 1 ml de PBS et fixer les CSPi avec 1 ml de solution de paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. Retirer la solution de paraformaldéhyde 4% et se laver les CSPi avec PBS 3 fois.
2. Ajouter un tampon de perméabilisation (tableau 1) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Retirer le tampon de perméabilisation et ajoute un tampon de blocage (tableau 1).
3. Incuber à température ambiante pendant 30 min. Pendant ce temps, diluer l'anticorps primaire (souris Oct3 anti-humaine / 4) à 1:50 dans un tampon de blocage.
4. Ajouter la solution d'anticorps primaire dilué et on incube à 4 ° C pendant une nuit.
5. Retirer la solution d'anticorps primaire dilué et laver les CSPi avec 1ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Pendant ce temps, le diluth de l'anticorps secondaire (chèvre anti-souris IgG / IgM) 1: 100 dans un tampon de blocage.
6. Ajouter la solution d'anticorps secondaire dilué et on incube à la température ambiante dans une chambre noire pendant 45 min.
7. Retirer la solution secondaire diluée et laver les CSPi avec 1 ml de PBS 3 fois, chacune pendant 5 min. Observer les CSPi sous microscopie immunofluorescence.

Résultats

La figure 1 représente la vue d' ensemble de la procédure qui implique l'expansion initiale du mélanome TIL avec rhIL-2, qui est suivie par une activation avec un anti-CD3 / CD28 et le transfert de gène de OCT3 / 4, KLF4, SOX2, et c-Myc pour TIL pour la production d'iPSCs. Habituellement, TIL sur la culture avec rhIL-2 commencent à se former des sphères 21-28 jours après le début de la culture. À ce stade, TIL sont prêts à être activés avec anti-...

Discussion

Ici, nous avons démontré un protocole pour la reprogrammation TIL de mélanome à CSPi par transduction SeV-médiation des quatre facteurs de transcription OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC. Cette approche, en utilisant un système de SeV pour reprogrammer les cellules T, offre l'avantage d'une méthode non intégrant ^7.

Une étude antérieure a montré qu'un système de reprogrammation du SeV a été très efficace et fiable pour reprogrammer non seulement les fibroblas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentle MACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentle MACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Tumor Dissociation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929
RPMI 1640	Life technologies	11875-093
Falcon 70 um Cell Strainer	BD	352350
BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes	BD	352070
IMDM	Life technologies	12440053
human AB serum	Life technologies	34005100
L-glutamine (200mM)	Life technologies	25030-081
2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)	Life technologies	21985-023
Penicillin-Streptomycin	Life technologies	15140-122
gentamicin	Life technologies	15750-060
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-02
D-PBS (-)	Life technologies	14040-133
recombinant human (rh) IL-2	Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3	BD	555329
Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28	BD	555725
X-VIVO 15	Lonza	04-418Q
FBS	Gibco	26140-079
HEPES	Life technologies	15630-080
N-Acetylcysteine	Cumberland Pharmaceuticals Inc.	NDC 66220-207-30
Falcon Tissue Culture Plates (6-well)	Corning	353046
Falcon Tissue Culture Plates (24-well)	Corning	353047
Sendai virus vector	DNAVEC
SNL feeder cells	Cell Biolabs, Inc	CBA-316
mitomycin C	SIGMA	M4287	soluble in water (0.5 mg/ml)
gelatin	SIGMA	G1890
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life technologies	PHG0264