抗体标记用荧光染料使用磁蛋白A和G蛋白珠

摘要

上的胎圈的方法用于标记抗体与小分子使抗体的少量的标记直接从细胞培养基。这种方法是与胺和硫醇化学相容，并且可以并行处理多个样品，手工或使用自动平台。

摘要

标有类似的荧光染料，细胞毒性药物和放射性示踪剂的小分子抗体是生物医学研究的重要工具，免疫诊断试剂以及最近作为治疗剂。对于小分子标记抗体的传统方法需要在相对高浓度的纯化抗体，涉及多个透析步骤和有限的吞吐量。然而，一些应用，包括抗体药物偶联物（ADC）的领域中，将可使用的新方法，这将允许抗体的标记直接从细胞培养基。这样的方法可以允许抗体在生物学相关测定法进行筛选，例如，在ADC的情况下，受体介导的抗体内测定。这里，我们描述的方法（小球上的方法），使少量的抗体的标记直接从细胞培养基。这种方法利用高容量磁蛋白A和G蛋白亲和珠捕获抗体从细胞培养基，随后通过标签使用任一胺或硫醇化学和标记抗体的随后洗脱的小分子。以荧光染料作为替代物的小分子，我们展示了三种不同的小鼠抗体的小球上的标签直接从同时使用胺和硫醇化学标记细胞培养基。抗体与蛋白A和蛋白G的高结合亲和力，确保高回收率，以及标记的抗体的纯度高。另外，使用的磁珠允许多个样品进行人工处理，从而显著提高标签的吞吐量。

引言

标记的小分子抗体是也许是生物学^1,2-最常用的试剂。用荧光染料标记和生物素的抗体在成像，免疫测定被广泛使用，流式细胞术，Western印迹，免疫沉淀和其他应用程序^3-6中。放射性标记的抗体^3,7-发现在成像和治疗，标有细胞毒性药物（ADC）的抗体广泛使用用于癌症的治疗中，提供新的选择，和两个ADC已经被批准用于治疗用途^8。尽管他们广泛使用，用于标记抗体的方法仍然令人惊讶的改变，通常涉及多个反应和脱盐步骤^9-12。溶液的方法中，其中只有少数的抗体需要被标记，并在高度纯化的形式提供在高浓度情况下，并且在足以卷工作得很好。然而，对于象ADC的新的应用程序，还有一个需要在早期杂交瘤细胞阶段来标记抗体，使它们可以筛选生物相关的属性，例如，受体介导的抗体的内化^13-16。在杂交瘤阶段，样品体积是有限的，抗体在低浓度下表达和若干样本都很大，因此在基于溶液的标记方法是不适合的。

简化和改进了传统的抗体标记方法的吞吐量，一些替代办法，已经提出^17,18。一种方法是使用非磁性蛋白装在小的列A亲和珠捕获抗体随后标记反应和标记的和纯化的蛋白的洗脱。这种方法可用于直接从细胞培养基标记的抗体，然而，使用列可以是费力。磁珠基于方法最近有报道^19，消除了使用列和提高吞吐量但由于在有限的抗体结合的珠容量，仅纳克至抗体的低微克量可以进行标记。

我们最近开发并用于高容量磁性蛋白A和蛋白G珠（> 20毫克人IgG /毫升沉降的珠子）标记存在于细胞培养基与小分子²⁰的抗体。珠的高容量允许几十到几百抗体微克能够方便标记和珠的快速磁响应简化的大量平行样品的处理和加工。使用荧光染料作为代理人为小分子，我们表明，该方法是与胺和硫醇化学标记兼容，并提供了标记，并非常纯净抗体的高回收率。

这个协议和所附视频描述存在于使用磁性蛋白A和蛋白G珠的细胞培养基小鼠抗体的小球上的标记。该协议是分为四个部分:第一部分介绍到生物样品珠抗体捕获。继拍摄，采用胺化学或使用硫醇化学与荧光染料抗体的标签在第2和第3节分别描述。最后，第4描述了一种用于抗体浓度的计算和染料与抗体的比例的方法。

研究方案

1.抗体捕获到高容量磁蛋白A或磁G蛋白珠

1. 均匀再通过暂停轻轻摇动磁珠。保持均匀的悬浮液珠等分的时候。
2. 加入50μl珠浆料到1.5ml微量离心管中。在磁力架，持续10秒的地方。小心取出存储缓冲区。
3. 加入250微升抗体结合缓冲。
4. 混合并在磁性支架10秒的地方。小心取出结合缓冲液。
5. ，增加1.0毫升含50-100微克抗体与珠粒样品。样品可被纯化在细胞培养基的抗体或抗体。
6. 使用涡旋混合器或最终过端混合器在RT混合样品60分钟。
7. 放置管在磁性支架10秒并除去上清液。
8. 加入250微升抗体结合/洗涤液混合。在磁性支架放置10秒，取出结合/洗涤缓冲液。重复这个STEP总共两次洗涤的。
9. 继续第2节使用胺化学或第3节使用硫醇化学标签抗体标签抗体。

2.抗体标记使用胺化学

1. 共轭抗体
   1. 添加100μl的胺偶联缓冲液中的珠。
   2. 通过加入100微升二甲基亚砜（DMSO）中的至1.0mg染料溶解在10毫克/毫升的胺反应性的荧光染料（AlexaFluor 532-SE）。震荡混合。使该解决方案使用前。
   3. 添加2.5微升的胺 - 反应性染料为100微克的抗体。
      注意:通常建议一个5-20摩尔过量活性染料。然而，反应性染料的量加入到反应需要根据所需染料与抗体比例和特性的抗体性质来凭经验优化。
   4. 使用涡旋混合器或最终过端混合器在RT混合样品60分钟。确保珠留在悬索桥ñ。
   5. 放置管在磁性支架10秒并除去上清液。
   6. 加入250微升抗体结合/洗涤液混合。在磁力架，持续10秒的地方。取下并丢弃绑定/洗涤液。重复此步骤，总共两次洗涤。
2. 抗体恢复
   1. 加入50μl洗脱缓冲液至珠。
   2. 使用涡旋混合器或最终过端混合器在RT混合5分钟。确保珠粒留在悬浮液中。
   3. 放置管在磁性支架10秒。除去洗脱样品，并转移到含有5微升中和缓冲液的一个新的微离心管中。
   4. 重复这个过程更多的时间，集中洗脱的样品。
   5. 定量抗体浓度，并如第4所述的染料与抗体的比例。

3.抗体标记使用硫醇化学

1. 减少抗体
   1. 加入250微升巯基结合缓冲和组合。放置管在磁性支架10秒。取下并丢弃缓冲区。重复此步骤两次。
   2. 加入100微升巯基结合缓冲。
   3. 添加二硫苏糖醇（DTT）至2.5mM的终浓度。
   4. 使用涡旋混合器或最终过端混合器在RT混合样品60分钟。确保珠粒留在悬浮液中。
   5. 放置管在磁性支架10秒，并丢弃缓冲器。
   6. 加入250微升巯基结合缓冲液混匀。放置管在磁性支架10秒。取下并丢弃缓冲区。重复此步骤，总共两次洗涤。
   7. 加入100微升巯基结合缓冲。
2. 共轭抗体
   1. 通过加入100微升的DMSO至1.0mg染料溶解在10毫克/毫升的硫醇反应性染料。震荡混合。使该解决方案使用前。
   2. 添加2.5微升硫醇反应性染料为100微克抗身体。
      注意:通常建议一个5-20摩尔过量活性染料。然而，反应性染料的量加入到反应需要根据所需染料与抗体比例和特性的抗体性质来凭经验优化。
   3. 使用涡旋混合器或最终过端混合器在RT混合样品60分钟。确保珠粒留在悬浮液中。
   4. 把试管磁力架，持续10秒，取出上清。
   5. 加入250微升巯基结合缓冲液混匀。在磁保持10秒的地方，去掉缓冲区。重复此步骤，总共两次洗涤。
3. 洗脱抗体
   1. 加入50μl洗脱缓冲液至珠。
   2. 使用涡旋混合器或最终过端混合器在RT混合5分钟。确保珠粒留在悬浮液中。
   3. 放置管在磁性支架10秒。删除洗脱样品，并转移到含有5微升NEUT的一个新的微离心管ralization缓冲区。
   4. 重复这个过程更多的时间，集中洗脱的样品。
   5. 定量抗体浓度，并如第4所述的染料与抗体的比例。

4.计算染料对抗体的比率

1. 测量抗体 - 染料偶联物的280nm处的吸光度（A280），并在λ最大为染料（安迈）。
2. 计算抗体浓度:
   抗体浓度（毫克/毫升）= A280 - （A× _最大 CF）/ 1.4
   其中，CF染料（由生产商提供的）的=校正因子。
3. 计算染料与抗体的比例:
   染料与抗体的比率（DAR）=（A _最大值 ×15万条）/抗体浓度（毫克/毫升）×ε _染料
   式中，ε _染料 =在其最大吸光度的染料的消光系数和抗体的分子量= 150000道尔顿。

结果

一种使用高容量磁性蛋白A和蛋白G磁珠标记的小分子的抗体概略示于图1。抗体上的磁性蛋白G珠可与小分子标记捕获，例如荧光染料，即使用胺化学哪些标签赖氨酸氨基酸或用硫醇化学哪些标签在抗体的铰链区还原硫醇的伯胺。抗体和蛋白G之间的亲和力强²¹和结果在标记反应中抗体的损失最小。相比简单的纯化时，这反映在与荧光染料标记后三种不同?...

讨论

本研究的目的是开发标记抗体中，存在于在低浓度的细胞培养基，具有多种小分子的方法。这种方法将允许大量的抗体，在抗体发现的早期阶段，与小分子进行标记，并使用生物相关测定法进行筛选。一种这样的测定法是受体介导的抗体的内化测定法，其中内化可能甚至具有相似的结合亲和力的抗体之间变化。因此，为了具体地筛选抗体除了传统的酶联基于免疫吸附测定（ELISA）筛选其内在特性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magne Protein A Beads	Promega Corporation	G8781
Magne Protein G Beads	Promega Corporation	G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)	Life Technologies	A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)	Life Technologies	A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)	Life Technologies	A20347
Fluorescein-ME (Maleimide)	Life Technologies	F-150
Magnetic Stand	Promega	Z5332