Anticorps marquage avec des colorants fluorescents en utilisant une protéine magnétique A et protéine G Perles

Résumé

La méthode à bille pour le marquage des anticorps avec de petites molécules permet l'étiquetage d'une petite quantité d'anticorps directement à partir de milieux cellulaires. Cette méthode est compatible avec une amine et de la chimie de thiol, et peut gérer plusieurs échantillons en parallèle, manuellement ou en utilisant des plates-formes automatisées.

Résumé

Les anticorps marqués avec de petites molécules comme des colorants fluorescents, des médicaments cytotoxiques, et des traceurs radioactifs sont des outils essentiels dans la recherche biomédicale, immunodiagnostic et plus récemment en tant qu'agents thérapeutiques. Les méthodes traditionnelles pour marquer des anticorps avec de petites molécules nécessitent des anticorps purifiés à une concentration relativement élevée, comportent plusieurs étapes de dialyse et ont un débit limité. Toutefois, plusieurs applications, y compris le domaine de conjugués anticorps-médicaments (CAN), bénéficieront de nouvelles méthodes qui permettront l'étiquetage des anticorps directement à partir de milieux cellulaires. De tels procédés peuvent permettre d'anticorps à cribler dans des essais biologiques pertinents, par exemple, l'anticorps intériorisation dosage médiée par le récepteur dans le cas de VPA. Ici, nous décrivons un (méthode à bille) procédé qui permet l'étiquetage de petites quantités d'anticorps directement à partir de milieux cellulaires. Cette approche utilise grande capacité magnétique protéine A et protéine G billes d'affinité pour capturer des anticorpsà partir des milieux cellulaires, suivi par un marquage avec de petites molécules en utilisant la chimie amine ou thiol, et l'élution subséquente des anticorps marqués. Prendre des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous démontrons l'étiquetage sur cordon de trois anticorps de souris différents directement à partir de milieux cellulaires utilisant à la fois amine et de la chimie de marquage thiol. La forte affinité de liaison des anticorps à la protéine A et la protéine G assure des recouvrements élevés ainsi que de haute pureté des anticorps marqués. En outre, l'utilisation de billes magnétiques permet de multiples échantillons à traiter manuellement, ce qui améliore considérablement l'étiquetage débit.

Introduction

Des anticorps marqués avec de petites molécules sont peut - être les réactifs les plus couramment utilisés en biologie ^1,2. Des anticorps marqués avec des colorants fluorescents et la biotine sont largement utilisés dans l' imagerie, les dosages immunologiques, cytométrie en flux, des transferts Western, immunoprécipitation et parmi d' autres applications ^3-6. Anticorps radiomarqués ^3,7- trouvent une utilisation extensive dans l' imagerie et la thérapie, des anticorps marqués avec des médicaments cytotoxiques (ADC) sont offrant de nouvelles options pour le traitement des cancers, et deux ADCs ont déjà été approuvés pour une utilisation thérapeutique ^8. En dépit de leur large utilisation, les méthodes d'anticorps étiquetage sont restés étonnamment inchangé et généralement impliquer de multiples réactions et de dessalage étapes ^9-12. Méthodes de résolution fonctionnent très bien dans les cas où seuls quelques anticorps doivent être étiquetés et sont disponibles sous une forme hautement purifiée à forte concentration et en quantité suffisante. Cependant, pour les applications plus récentes comme ADCs, il y a unbesoin d'étiqueter des anticorps au stade précoce d'hybridome de sorte qu'ils peuvent être criblés pour des propriétés biologiques pertinents, par exemple, médiée par un récepteur d' anticorps intériorisation ^13-16. Au stade de l'hybridome, des volumes d'échantillons sont limités, les anticorps sont exprimés à de faibles concentrations et un certain nombre d'échantillons sont grandes, donc des méthodes d'étiquetage basées sur des solutions ne sont pas adaptés.

Pour simplifier et améliorer le débit des méthodes de marquage des anticorps traditionnels, quelques approches alternatives ont été proposées ^17,18. Une approche consiste à utiliser la protéine amagnétique A billes d'affinité emballés dans de petites colonnes pour capturer des anticorps suivie par la réaction de marquage et l'élution de la protéine marquée et purifiée. Cette méthode peut être utilisée pour marquer les anticorps directement à partir de milieux cellulaires, cependant, l'utilisation de colonnes peut être laborieuse. Un procédé basé sur des billes magnétiques a été récemment rapporté ¹⁹ qui élimine l'utilisation de colonnes et de débit mais à cause amélioreà l'anticorps capacité limitée des billes de liaison, seulement nanogramme à des quantités faibles de microgramme des anticorps pourrait être étiqueté.

Nous avons récemment développé et utilisé une grande capacité magnétique protéine A et protéine G perles (> 20 mg d'IgG / ml de perles sédentaires humain) pour étiqueter des anticorps présents dans les milieux de cellules avec de petites molécules ^20. La capacité élevée des bourrelets permet de dizaines à des centaines de microgrammes d'anticorps à marquer facilement et rapidement la réponse magnétique des billes simplifie la manipulation et le traitement d'un grand nombre d'échantillons en parallèle. En utilisant des colorants fluorescents comme substituts pour les petites molécules, nous montrons que la méthode est compatible avec amine et thiol étiquetage chimie et offre des recouvrements élevés d'anticorps marqués et très purs.

Ce protocole et la vidéo qui l'accompagne décrivent l'étiquetage sur cordon de anticorps de souris présents dans les médias de cellules en utilisant la protéine magnétique A et protéine G perles. Le protocole estdivisé en quatre sections: Section 1 décrit la capture d'anticorps sur le cordon à partir d'échantillons biologiques. Après la capture, le marquage des anticorps avec un colorant fluorescent à l'aide de la chimie amine ou en utilisant la chimie thiol est décrite dans les sections 2 et l'article 3, respectivement. Enfin, la section 4 décrit la méthode pour le calcul de la concentration d'anticorps et le colorant au rapport de l'anticorps.

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Protocole

1. Anticorps de capture sur High Capacity Protein magnétique A ou la protéine G Magnetic Beads

1. Uniformément re-suspension des billes magnétiques par agitation douce. Gardez l'uniforme de suspension lorsque aliquotage perles.
2. Ajouter 50 pi de perles suspension à un tube de 1,5 ml. Placez dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirez délicatement le tampon de stockage.
3. Ajouter 250 pi de tampon de liaison d'anticorps.
4. Mélanger et placer dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirez délicatement le tampon de liaison.
5. Ajouter 1,0 ml de l'échantillon contenant 50 à 100 ug d'anticorps aux billes. Les échantillons peuvent être purifiés des anticorps ou des anticorps dans le milieu cellulaire.
6. Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end.
7. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant.
8. Ajouter 250 pi de tampon de liaison / lavage anticorps et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 secondes et éliminer le tampon de liaison / lavage. Répétez cette sTep pour un total de deux lavages.
9. Passez à la section 2 pour les anticorps de l'étiquette en utilisant la chimie amine ou à l'article 3 aux anticorps de l'étiquette en utilisant la chimie de thiol.

2. Anticorps Étiquetage utilisant Amine Chemistry

1. Anticorps conjugué
   1. Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison aminé aux billes.
   2. Dissoudre les colorants fluorescents réagissant avec les amines (AlexaFluor 532-SE) à 10 mg / ml par addition de 100 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 1,0 mg de colorant. Mélanger par tourbillonnement. Faire de cette solution juste avant l'utilisation.
   3. Ajouter 2,5 ul de colorant avec une amine pour 100 pg d'anticorps.
      Note: En général, un excès molaire 5-20 de colorant réactif est recommandé. Cependant, la quantité de colorant réactif ajouté à la réaction doit être optimisé de manière empirique en fonction de colorant désiré ratio d'anticorps et d'anticorps propriétés intrinsèques.
   4. Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
   5. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant.
   6. Ajouter 250 pi de tampon de liaison / lavage anticorps et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer et jeter le tampon de liaison / lavage. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
2. antibody Recovery
   1. Ajouter 50 pi de tampon d'élution aux billes.
   2. Mélanger pendant 5 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
   3. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer l'échantillon et le transfert élué dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 5 pi de tampon de neutralisation.
   4. Répétez le processus une fois de plus et mettre en commun les échantillons élues.
   5. Quantifier la concentration d'anticorps et de colorant à anticorps rapport tel que décrit dans la section 4.

3. Anticorps Étiquetage utilisant thiol Chemistry

1. Réduction des anticorps
   1. Ajouter 250 pide tampon de conjugaison thiol et mix. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 s. Retirer et jeter le tampon. Répéter deux fois cette étape.
   2. Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison thiol.
   3. Ajouter du dithiothréitol (DTT) jusqu'à une concentration finale de 2,5 mM.
   4. Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
   5. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et éliminer le tampon.
   6. Ajouter 250 pi de tampon de conjugaison thiol et mélanger. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 s. Retirer et jeter le tampon. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
   7. Ajouter 100 pi de tampon de conjugaison thiol.
2. Anticorps conjugué
   1. Dissoudre le colorant réactif thiol à 10 mg / ml par addition de 100 ul de DMSO à 1,0 mg de colorant. Mélanger par tourbillonnement. Faire de cette solution juste avant l'utilisation.
   2. Ajouter 2,5 pi de colorant thiol réactif pour 100 ug d'anticorps.
      Note: En général, un excès molaire 5-20 de colorant réactif est recommandé. Cependant, la quantité de colorant réactif ajouté à la réaction doit être optimisé de manière empirique en fonction de colorant désiré ratio d'anticorps et d'anticorps propriétés intrinsèques.
   3. Mélanger l'échantillon pendant 60 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
   4. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le surnageant.
   5. Ajouter 250 pi de tampon de conjugaison thiol et mélanger. Placez dans le support magnétique pendant 10 secondes et retirer le tampon. Répétez cette étape pour un total de deux lavages.
3. Eluer Anticorps
   1. Ajouter 50 pi de tampon d'élution aux billes.
   2. Mélanger pendant 5 min à température ambiante en utilisant un mélangeur à vortex ou mélangeur à tambour-end. Assurez-vous que les perles restent en suspension.
   3. Placer le tube dans le support magnétique pendant 10 sec. Retirer l'échantillon et le transfert élué dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse contenant 5 pi de neutun tampon de ralization.
   4. Répétez le processus une fois de plus et mettre en commun les échantillons élues.
   5. Quantifier la concentration d'anticorps et de colorant à anticorps rapport tel que décrit dans la section 4.

Ratio 4. Calculer Dye-to-Antibody

1. Mesurer l'absorbance du conjugué anticorps-colorant à 280 nm (A280) et à l'Xmax pour le colorant (Amax).
2. Calculer la concentration d'anticorps:
   Anticorps Concentration (mg / ml) = A280 - (A × _max CF) / 1,4
   où CF = facteur de correction du colorant (fourni par le fabricant).
3. Calculer le rapport colorant à l'anticorps:
   Colorant à l' anticorps Ratio (DAR) = (A _max × 150 000) / Ab concentration (mg / ml) x ε _colorant
   où ε _colorant = coefficient d'extinction du colorant à son maximum d'absorption et le poids moléculaire de l' anticorps = 150 000 Da.

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Résultats

Un schéma de marquage d' anticorps avec de petites molécules en utilisant une grande capacité magnétique de la protéine A et la protéine G billes est représenté sur la figure 1. Les anticorps capturés sur la protéine magnétique G billes peuvent être marquées avec de petites molécules, par exemple des colorants fluorescents, en utilisant la chimie des amines qui marque des amines primaires de la lysine, des acides aminés ou en utilisant la chimie thiol ...

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Discussion

Le but de cette étude était de développer un procédé pour marquer des anticorps présents dans le milieu cellulaire à des concentrations faibles, avec une variété de petites molécules. Un tel procédé permettra à un grand nombre d'anticorps, au cours des premiers stades de la découverte d'anticorps, à marquer avec de petites molécules et tamisé en utilisant un essai biologique approprié. Un tel essai est l'anticorps intériorisation dosage médiée par le récepteur lorsque l'internalisat...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magne Protein A Beads	Promega Corporation	G8781
Magne Protein G Beads	Promega Corporation	G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)	Life Technologies	A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)	Life Technologies	A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)	Life Technologies	A20347
Fluorescein-ME (Maleimide)	Life Technologies	F-150
Magnetic Stand	Promega	Z5332