JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

küçük moleküller ile antikorlar için etiketleme üzerine boncuk yöntem doğrudan hücre ortamından antikorlar, az miktarda etiketleme sağlar. Bu yöntem amin ve tiyol kimyası ile uyumlu ve paralel olarak çoklu örnekleri, elle veya otomatik platformları kullanarak işleyebilir.

Özet

Floresan boyalar, sitotoksik ilaçlar ve radyoaktif iz gibi küçük moleküller ile işaretlenmiş olan antikorlar, esas biyomedikal araştırmalarda araçları, bağışıklıkla ilgili tanı ve daha yakın olarak terapötik maddelerdir. küçük moleküller ile markalama antikorlar için geleneksel yöntemler, nispeten yüksek bir konsantrasyonda antikor saflaştınldı birden diyaliz adımları içerir ve veri akışını sınırlı gerektirir. Ancak, Antikor İlaç Eşlenikleri (ADC) alanında olmak üzere çeşitli uygulamalar, hücre ortamından doğrudan antikorların etiketleme sağlayacak yeni yöntemler yararlanacaktır. Bu tür yöntemler antikorlar örneğin, biyolojik olarak uygun deneylerde taranabilir izin verebilir, ADC'ler halinde reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyi. Burada, doğrudan hücre ortamından antikorlar küçük miktarlarda etiketleme sağlayan bir yöntem olup (on-boncuk yöntemi) tarif eder. Bu yaklaşım antikorları yakalamak için yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G afinite boncuklar kullanıramin veya tiyol kimya ve etiketlenmiş antikorlar daha sonra elüsyon kullanılarak küçük moleküller ile etiketleme ve ardından hücre ortamından. küçük moleküller için suretler olarak floresan boyalar alırsak, biz doğrudan amin ve tiyol etiketleme kimyası her ikisini de kullanarak hücre medyadan üç farklı fare antikorları on-boncuk etiketleme göstermektedir. Protein A ve Protein G antikorların yüksek bağlanma afinitesi, yüksek geri kazanımlar olarak etiketlenmiş antikorların yüksek saflıkta sağlar. Buna ek olarak, manyetik boncuk kullanımı çoklu numuneler önemli oranda markalama verimliliği arttırır, elle kullanılmasına izin verir.

Giriş

Küçük moleküller ile etiketli antikorlar, belki de biyoloji 1,2 en yaygın olarak kullanılan reaktiflerdir. Floresan boyalar ve biyotin ile etiketlenmiş antikorlar yoğun diğer uygulamalar 3-6 arasında sitometrisi Western blot ve immüno-çökeltme, akış görüntüleme, bağışıklık kullanılır. Radyoaktif işaretli antikorlar 3,7 kanserlerin tedavisi için yeni seçenekler sunuyoruz, ve iki ADC zaten terapötik kullanım 8 için onaylanmıştır görüntüleme ve tedavi, sitotoksik ilaçlar (ADK) ile etiketlenmiş antikorlar yaygın kullanım bulmaktadır. Bunların yaygın kullanımı olmasına rağmen, etiketleme antikorlar için yöntemler şaşırtıcı değişmemiş ve tipik olarak çok sayıda reaksiyonlar içerir ve tuz giderme 9-12 aşama vardır. Çözüm yöntemleri sadece birkaç antikorlar etiketlenmesi gerekir ve yüksek konsantrasyonda yüksek arıtılmış formda mevcut olduğu durumlarda ve yeterli hacimlerde çok iyi çalışmaz. Ancak, ADK gibi yeni uygulamalar için, orada birBunlar, örneğin, reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme 13-16 için, biyolojik olarak uygun özellikler için taranabilir erken böylece hibridom aşamasında antikorlar etiket gerekir. hibridom aşamada, numune hacimleri antikorlar düşük konsantrasyonlarda ifade numune sayısı dolayısıyla çözelti bazlı etiketleme yöntemleri uygun değildir, büyük olan, sınırlıdır.

Basitleştirmek ve geleneksel antikor etiketleme yöntemleri verimini artırmak için, birkaç alternatif yaklaşımlar 17,18 önerilmiştir. Bir yaklaşım, etiketleme reaksiyonu ve etiketlenmiş, saflaştırılmış protein tasfiye edilir antikorları yakalamak için manyetik olmayan Proteini küçük sütunlarda paketlenmiş bir afinite taneleri kullanmaktır. Bu yöntem, hücre ortamı şirketinden antikorları etiketlemek için kullanılabilir, ancak sütun kullanımı zahmetli olabilir. Bir manyetik boncuk tabanlı bir yöntem son zamanlarda sütun kullanımını ortadan kaldırır ve hacmini fakat geliştirir 19 rapor edilmiştirboncuk bağlama kapasitesi, sınırlı antikora, alçak antikor mikrogram düzeylerindeki miktarlarda sadece nanogram etiketlenmiş olabilir.

Biz son zamanlarda geliştirilen ve yüksek kapasitesi manyetik Protein A ve Protein G boncuk (> İnsan IgG / yerleşik boncuk ml 20 mg) küçük moleküller 20 hücre medyada mevcut antikorları etiketlemek için kullanılır. tanelerin yüksek kapasiteli antikorun mikrogram On ila yüzlerce uygun etiketlenmesine izin verir ve boncuk hızlı bir manyetik müdahale paralel örneklerin çok sayıda taşıma ve işleme kolaylaştırır. Küçük moleküller için belirteç gibi floresan boyalar kullanarak, yöntem, bir amin ve tiyol markalama kimya ile uyumlu ve etiketlenmiş ve çok saf antikorların yüksek geri kazanımlar sahip olduğunu gösteriyor.

Bu protokol ve beraberindeki bir video Manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak hücre medyada mevcut fare antikorları üzerinde boncuk etiketleme açıklar. protokoldürdört bölüme ayrılır: Bölüm 1 biyolojik örneklerden boncuk üzerine antikorların fethini şöyle anlatır. yakalanmasını takiben, amin kimyası kullanılarak veya tiyol kimya kullanılarak floresan boya ile antikor etiketleme sırasıyla 2 ve 3. bölümde tarif edilmektedir. Son olarak, bölüm 4 antikoru konsantrasyonu hesaplamalar ve antikor oranı boya için bir yöntem açıklanır.

Protokol

Yüksek Kapasiteli Manyetik Protein A veya Manyetik Protein G Boncuk üzerine 1. Antikor Yakalama

  1. Düzgün nazik sallayarak manyetik boncuk yeniden askıya. boncuk aliquoting Süspansiyon üniforma tutun.
  2. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne boncuk çamuru 50 ul ekle. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Dikkatle depolama tamponu çıkarın.
  3. Antikor bağlama tamponu, 250 ul ekleyin.
  4. Mix ve 10 saniye manyetik stand koyun. Dikkatle bağlayıcı tampon kaldırmak.
  5. tanelerine antikorun 50-100 ug ihtiva eden numune 1.0 ml ilave edilir. Numuneler, hücre ortamında antikorlar ya da antikor arıtılabilir.
  6. vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın.
  7. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak.
  8. antikor bağlama / yıkama tamponu 250 ul ilave et ve karıştır. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun ve bağlayıcı / yıkama tamponu çıkarın. Bu s tekrarlayınİki yıkar toplam TEP.
  9. amin kimyası veya Bölüm 3 tiol kimyası kullanılarak etiketli antikorlar kullanılarak etiket antikorlara Bölüm 2'ye geçin.

Amin kimyası kullanılarak 2. Antikor etiketleme

  1. Konjuge Antikor
    1. Boncuklar amin konjugasyon tampon 100 ul ekle.
    2. boyanın 1.0 mg dimetil sülfoksit (DMSO), 100 ul ekleyerek, 10 mg / ml'de bir amin-reaktif floresan boyalar (AlexaFluor 532-K) içinde çözülür. vorteks ile karıştırın. Kullanımdan hemen önce bu çözüm olun.
    3. antikorun, 100 ug amin-reaktif boya 2.5 ul ekle.
      Not: Genellikle reaktif boyanın 5-20 mol fazlası önerilir. Bununla birlikte, reaktif boyanın miktarı, reaksiyon ampirik antikor oranı ve içsel antikor özellikleri arzu edilen boya bağlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir ilave edildi.
    4. vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk suspensio kalır emin olunn.
    5. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak.
    6. antikor bağlama / yıkama tamponu 250 ul ilave et ve karıştır. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Çıkarın ve bağlayıcı / yıkama tamponu atın. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın.
  2. antikor Kurtarma
    1. tanelerine elüsyon tamponu 50 ul ekle.
    2. vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
    3. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. nötralizasyon tamponu 5 ul içeren yeni bir mikro-santrifüj tüpüne yıkandı örnek ve transfer çıkarın.
    4. sürecini bir kez daha tekrarlayın ve yıkandı, örnekleri havuz.
    5. antikor konsantrasyonunu ölçmek ve boya için antikor oranı Bölüm 4'te tarif edildiği gibi.

Tiol kimyası kullanılarak 3. Antikor etiketleme

  1. antikor Azaltma
    1. 250 ul ekleyintiyol konjugasyon tampon ve karışımı. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. Çıkarın ve tampon atın. İki kez bu adımı yineleyin.
    2. tiyol konjugasyon tampon 100 ul ekleyin.
    3. 2.5 mM'lik bir son konsantrasyona ditiyotreitol (DTT) ilave edilir.
    4. vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
    5. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve tampon atın.
    6. tiyol konjugasyon tampon 250 ul ekleyin ve karıştırın. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. Çıkarın ve tampon atın. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın.
    7. tiyol konjugasyon tampon 100 ul ekleyin.
  2. Konjuge Antikor
    1. boyanın 1.0 mg DMSO, 100 ul ekleyerek / ml 10 mg tiol-reaktif boya çözülür. vorteks ile karıştırın. Kullanımdan hemen önce bu çözüm olun.
    2. anti 100 ug için tiol-reaktif boya 2.5 ul eklevücut.
      Not: Genellikle reaktif boyanın 5-20 mol fazlası önerilir. Bununla birlikte, reaktif boyanın miktarı, reaksiyon ampirik antikor oranı ve içsel antikor özellikleri arzu edilen boya bağlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir ilave edildi.
    3. vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
    4. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak.
    5. tiyol konjugasyon tampon 250 ul ekleyin ve karıştırın. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun ve tampon kaldırmak. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın.
  3. Zehir Antikor
    1. tanelerine elüsyon tamponu 50 ul ekle.
    2. vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun.
    3. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. neut 5 ul içeren yeni bir mikro-santrifüj tüpüne yıkandı örnek ve transfer çıkarınralization tamponu.
    4. sürecini bir kez daha tekrarlayın ve yıkandı, örnekleri havuz.
    5. antikor konsantrasyonunu ölçmek ve boya için antikor oranı Bölüm 4'te tarif edildiği gibi.

4. Hesapla Dye-to-Antikor Oranı

  1. 280 nm (A280) de ve boya (Amak) için Xmaks antikor boya birleşimine absorbansı ölçülür.
  2. antikor konsantrasyonunu hesaplayın:
    Antikor konsantrasyonu (mg / ml) = A280 - (CF x A max) / 1.4
    nerede CF (üretici tarafından sağlanan) boya = düzeltme faktörü.
  3. boya-to-antikora oranı hesaplanır:
    Boya-to-antikor oranı (DAR) = (150,000 x A max) / Ab konsantrasyonu (mg / ml) x ε boyası
    burada, ε boya = sönüm absorbansı en fazla boyanın katsayısı ve antikorun molekül ağırlığı = 150.000 Da.

Sonuçlar

Yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak küçük moleküller ile antikor etiketleme için bir şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Antikorlar etiketler amin kimyası kullanılarak, örneğin flüoresan boyalar, G boncuklar küçük moleküller ile etiketlenebilir manyetik Protein çekilen lizin amino asitler ya da antikor menteşe bölgesindeki düşük tiyoller etiketler, tiol kimya kullanılarak birincil aminlerdir. Antikorlar...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, küçük moleküllerin çeşitli, düşük konsantrasyonlarda, hücre ortamı içinde mevcut antikorları etiket için bir yöntem geliştirmektir. Antikor keşif erken safhalarında antikorların çok sayıda olanak sağlayacaktır bir yöntem olup, küçük moleküller ile işaretlenmiş olan bir biyolojik ilgili deneyi kullanılarak taranabilir için. Böyle bir deney, içselleştirme da benzer bağlanma afinitelerine sahip antikorlar arasında değişebilir reseptör aracılı antikor, geli...

Açıklamalar

Authors are employees of Promega Corporation.

Teşekkürler

None.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Magne Protein A BeadsPromega Corporation G8781
Magne Protein G BeadsPromega Corporation  G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)Life TechnologiesA20347
Fluorescein-ME (Maleimide)Life TechnologiesF-150
Magnetic StandPromegaZ5332

Referanslar

  1. Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
  2. Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
  3. Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
  4. Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
  5. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
  6. Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
  7. Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
  8. Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
  9. Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
  10. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).
  11. Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
  12. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  13. Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
  14. Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).
  15. Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
  16. Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
  17. Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
  18. Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
  19. Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
  20. Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
  21. Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
  22. Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).
  23. Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
  24. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
  25. Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ImmunologySay 115Antikor etiketlemeantikorgeli tirilmi i selle tirmefloresan boyaantikor ila konjugatmanyetik Protein A boncukmanyetik Protein G boncuk

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır