형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

요약

작은 분자와 항체를 라벨에 대한 온 - 비드 방법은 직접 세포 미디어에서 항체의 소량의 라벨 수 있습니다. 이 방법은 아민 및 티올 화학과 호환 가능하며, 병렬로 다수의 시료를 수동 또는 자동 플랫폼을 사용하여 처리 할 수​​있다.

초록

형광 염료, 세포 독성 약물, 방사성 추적자 같은 작은 분자 표지 항체는 필수적인 생물 의학 연구 도구, immunodiagnostics 그리고 최근과 같은 치료제이다. 작은 분자 표지 항체에 대한 전통적인 방법은 상대적으로 높은 농도로 항체를 정제 여러 투석 단계를 포함하고 처리량을 제한 필요합니다. 그러나, 항체 약물 결합체 (ADC)는 분야를 포함한 여러 응용 프로그램은, 세포 미디어에서 직접 항체의 라벨을 허용하는 새로운 방법에서 도움이됩니다. 이러한 방법은 항체, 예를 들어, 생물학적 관련 분석법에서 선별 할 수 있으며, ADC는 경우의 수용체 - 매개 된 항체 내재화 분석. 여기서는 직접 세포 배지에서 항체의 적은 양의 표지를 가능하게하는 방법 (온 비드 법)을 설명한다. 이 방법은 항체를 캡처하는 고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 친 화성 구슬을 이용아민 또는 티올 화학 표지 된 항체의 후속 용출을 사용하여 작은 분자로 표지 하였다 셀 매체. 작은 분자에 대한 대용으로 형광 염료를 복용, 우리는 직접 아민과 티올 라벨 화학을 모두 사용하여 셀 미디어에서 세 가지 다른 마우스 항체의 온 - 비드 라벨을 보여줍니다. 단백질 A와 단백질 G 항체의 높은 결합 친화도가 높은 회수율뿐만 아니라 표지 된 항체의 순도를 보장한다. 또한, 자성 비드를 사용하여 여러 샘플 크게 라벨링 스루풋을 향상 수동으로 취급 될 수있다.

서문

작은 분자로 표지 된 항체는 아마도 생물학 ^1,2-에서 가장 일반적으로 사용되는 시약이다. 형광 염료 및 비오틴 표지 항체는 광범위하게 다른 응용 프로그램 ^3-6 사이, 세포 계측법 서쪽 오 점, 그리고 면역 흐름, 이미징, 면역에 사용됩니다. 방사성 표지 항체는 ^3,7 암의 치료를위한 새로운 옵션을 제공하고, 2 개의 ADC를 이미 치료 사용 ⁽⁸⁾ 승인 된 이미징 및 치료, 세포 독성 약물 (ADC)는 표지 항체에 광범위하게 사용을 찾을 수 있습니다. 자신의 광범위한 사용에도 불구하고, 라벨 항체의 방법은 놀라 울 정도로 변화가 없었다 일반적으로 여러 반응을 포함하고 탈염는 ^{9 ~ 12 단계를했다.} 해결 방법은 단 몇 항체가 표시 될 필요가 높은 농도로 고도로 정제 된 형태로 사용할 수있는 경우에 충분한 볼륨에서 매우 잘 작동합니다. 그러나 ADC를 같은 새로운 애플리케이션을 위해 존재하는그들은 예를 들어, 수용체 매개 항체 내재화 ^13-16에 대한 생물학적 관련 특성에 대한 검사를 할 수 있도록 초기 하이 브리 도마 단계에서 항체 레이블을해야합니다. 하이 브리 도마 단계에서 샘플 볼륨 항체는 낮은 농도로 발현되고 샘플들의 수는 이에 기반 솔루션 라벨링 방법이 적합하지 않다, 큰되어 제한된다.

단순화 전통적인 항체 라벨링 방법의 처리율을 향상시키기 위해 몇 가지 다른 방식은 ^{17, 18을} 제안되어있다. 하나의 방법은 표지 및 표지 반응 및 정제 된 단백질의 용출에 이어 항체를 캡처하는 비자 성 단백질을 작은 열 충전 한 화성 비드를 사용하는 것이다. 이 방법은 세포 배지로부터 직접 항체 라벨을 사용할 수 있지만, 컬럼의 사용은 힘든 일 수있다. 자기 비드 기반 방법은 최근 컬럼의 사용을 제거하고 처리량 그러나 때문에 개선이 ^19보고 된 바있다구슬의 능력을 결합 제한 항체, 항체의 낮은 마이크로 그램 수량 만 나노 그램이 표시 될 수 있습니다.

우리는 최근에 개발 된 고용량에게 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈 (> 인간 IgG / 정착 구슬 ml의 20 mg)을 작은 분자 ^(20)와 세포 미디어에 존재하는 항체 레이블을 사용합니다. 비드의 고용량은 항체의 마이크로 그램의 수십 내지 수백 편리한 라벨되도록 비드의 신속한 자기 응답 병렬 샘플들의 다수의 취급 및 처리를 단순화한다. 작은 분자에 대한 대용으로 형광 염료를 사용하여, 우리는 방법은 아민과 티올 라벨 화학와 호환되며 라벨이 매우 순수 항체의 높은 회수율을 제공하고 있음을 보여준다.

이 프로토콜 및 첨부 영상 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 이용하여 세포 배지에 존재하는 마우스 항체에 비드 레이블링을 설명한다. 이 프로토콜은네 개의 섹션으로 나누어 : 1 절은 생물학적 시료에서 비드에 항체의 캡처를 설명합니다. 캡쳐 후에, 화학 제를 사용하여, 아민 또는 티올 화학 제를 사용하여 형광 색소와 항체의 표지는 각각 2 항과 제 3 항에 기재되어있다. 마지막으로, (4) 항체 농도의 계산 및 항체 비 염색하는 방법을 설명한다.

프로토콜

고용량 자기 단백질 A 또는 자기 단백질 G 비즈 상 1. 항체 캡처

1. 균일 부드러운 흔들림에 의한 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다. 구슬을 분취 때 서스펜션 유니폼을 유지합니다.
2. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 비드 슬러리의 50 μl를 추가합니다. 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 조심스럽게 저장 버퍼를 제거합니다.
3. 항체 결합 버퍼의 250 μl를 추가합니다.
4. 혼합하고 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 조심스럽게 결합 버퍼를 제거합니다.
5. 구슬에 항체의 50 ~ 100 μg의를 포함하는 샘플의 1.0 ML을 추가합니다. 시료는 세포 배지에서 항체 또는 항체를 정제 할 수있다.
6. 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다.
7. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓고 뜨는을 제거합니다.
8. 항체 결합 / 세척 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 놓고 바인딩 / 세척 버퍼를 제거합니다. 이 S 반복두 세척 총 TEP.
9. 아민 화학 또는 제 3 항에 티올 화학 제를 사용하여 라벨 항체에를 사용하여 라벨 항체에 제 2로 넘어갑니다.

아민 화학을 사용하여 2. 항체 라벨링

1. 복합체 항체
   1. 구슬에 아민 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다.
   2. 색소 1.0 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 100 μL를 첨가하여 10 ㎎ / ㎖의 아민 반응성 형광 염료 (AlexaFluor 532-SE)를 녹인다. 텍싱에 의해 섞는다. 그냥 사용하기 전에이 솔루션을합니다.
   3. 항체의 100 μg의에 대한 아민 반응성 염료의 2.5 μl를 추가합니다.
      참고 : 일반적으로 반응성 염료의 5 ~ 20 몰 과량을 권장합니다. 그러나, 반응성 염료의 양이 반응이 경험적으로 항체 비율과 고유 항체 속성에 원하는 염료에 따라 최적화 할 필요가에 추가.
   4. 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 suspensio에 남아 있는지 확인엔.
   5. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓고 뜨는을 제거합니다.
   6. 항체 결합 / 세척 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 배치합니다. 제거하고 결합 / 세척 버퍼를 폐기합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다.
2. 항체 복구
   1. 구슬로 용출 버퍼의 50 μl를 추가합니다.
   2. 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 혼합기를 사용하여 RT에서 5 분 동안 혼합한다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다.
   3. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 중화 버퍼의 5 μl를 포함하는 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 용출 샘플 및 전송을 제거합니다.
   4. 프로세스를 한 번 더 반복 용출 샘플을 풀.
   5. 항체 농도 정량 염료 투 항체 비율 섹션 4에 기술 된 바와 같이.

티올 화학을 사용하여 3. 항체 라벨링

1. 항체 감소
   1. 250 μl를 추가티올 결합 버퍼와 혼합. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 제거하고 버퍼를 폐기합니다. 두 번이 단계를 반복합니다.
   2. 티올 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다.
   3. 2.5 mM의 최종 농도로 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가한다.
   4. 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다.
   5. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 버퍼를 폐기합니다.
   6. 티올 결합 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 제거하고 버퍼를 폐기합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다.
   7. 티올 결합 버퍼의 100 μl를 추가합니다.
2. 복합체 항체
   1. 색소 1.0 mg의 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 / ㎖에서 10 mg의 티올 - 반응성 염료를 녹인다. 텍싱에 의해 섞는다. 그냥 사용하기 전에이 솔루션을합니다.
   2. 안티의 100 μg의에 대한 티올 - 반응성 염료의 2.5 μl를 추가신체.
      참고 : 일반적으로 반응성 염료의 5 ~ 20 몰 과량을 권장합니다. 그러나, 반응성 염료의 양이 반응이 경험적으로 항체 비율과 고유 항체 속성에 원하는 염료에 따라 최적화 할 필요가에 추가.
   3. 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 믹서로 실온에서 60 분 동안 샘플을 섞는다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다.
   4. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 상층 액을 제거합니다.
   5. 티올 결합 버퍼의 250 μl를 추가하고 혼합한다. 10 초 동안 자기 스탠드에 놓고 버퍼를 제거합니다. 이 세척의 총에 대해이 단계를 반복합니다.
3. 용출 항체
   1. 구슬로 용출 버퍼의 50 μl를 추가합니다.
   2. 볼텍스 믹서 엔드 오버 엔드 혼합기를 사용하여 RT에서 5 분 동안 혼합한다. 구슬이 서스펜션에 남아 있는지 확인합니다.
   3. 10 초 동안 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. neut의 5 μl를 포함하는 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 용출 샘플 및 전송을 제거ralization 버퍼입니다.
   4. 프로세스를 한 번 더 반복 용출 샘플을 풀.
   5. 항체 농도 정량 염료 투 항체 비율 섹션 4에 기술 된 바와 같이.

4. 계산 염료로 항체 비율

1. 파장 280nm (A280)에서 상기 염료 (AMAX)에 λmax에서 항체 - 염료 접합체의 흡광도를 측정한다.
2. 항체 농도를 계산한다 :
   항체 농도 (㎎ / ㎖) A280 = - (CF × _최대) / 1.4
   여기서 CF (제조업체에서 제공) 염료 = 보정 계수.
3. 염료에 대한 항체의 비율을 계산한다 :
   염료 - 투 - 항체 비율 (DAR) = (15 × _최대) / Ab의 농도 (㎎ / ㎖) × ε _염료
   여기서, ε = _염료의 흡광의 흡광도 최대 염료의 계수 및 항체의 분자량 = 150,000 다.

결과

고용량 자기 단백질 A와 단백질 G 비드를 사용하는 작은 분자로 항체를 라벨링하는 개략도는도 1에 도시되어있다. 항체 라벨 아민 화학 제를 사용하여, 예컨대, 형광 염료, G 비드 작은 분자로 표지 될 수있는 자기 단백질 캡처 리신 아미노산 또는 항체의 힌지 영역에서 환원 된 티올로 라벨 티올 화학 제를 사용하여 일차 아민. 항체 및 단백질 G 사이의 선호도 ?...

토론

이 연구의 목적은 작은 분자의 다양한 낮은 농도에서 세포 배지에서 본 발명의 항체를 라벨 할 수있는 방법을 개발 하였다. 항체 탐색의 초기 단계에서 항체의 다수를 허용 이러한 방법은 작은 분자 표지 및 생물학적 관련성 분석을 이용하여 선별한다. 그러한 분석은 국제화도 유사한 결합 친 화성을 가진 항체 사이에 다를 수 있습니다 수용체 매개 항체 내재화 분석이다. 따라서, 기존의 효소 결?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magne Protein A Beads	Promega Corporation	G8781
Magne Protein G Beads	Promega Corporation	G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)	Life Technologies	A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)	Life Technologies	A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)	Life Technologies	A20347
Fluorescein-ME (Maleimide)	Life Technologies	F-150
Magnetic Stand	Promega	Z5332