Антитело Этикетировочное с флуоресцентными красителями с использованием магнитных Protein A и G белка бусин

Резюме

Метод по-бусинки для мечения антител с небольшими молекулами позволяет маркировать небольшого количества антител непосредственно из клеточных сред. Этот метод совместим с амином и химии тиольной, и может обрабатывать несколько образцов параллельно, вручную или с помощью автоматизированных платформ.

Аннотация

Антитела, меченные малыми молекулами, такими как флуоресцентные красители, цитотоксическими лекарственными средствами, а также радиоактивных индикаторов являются важными инструментами в области биомедицинских исследований, иммунодиагностики и совсем недавно в качестве терапевтических средств. Традиционные методы маркировки антител с малыми молекулами требуют очищенных антител при относительно высокой концентрации, включают много стадий диализ и имеют ограниченную пропускную способность. Тем не менее, несколько приложений, в том числе области антитела Drug конъюгатов (АЦП), выиграют от новых методов, которые позволят мечение антител непосредственно из клеточных сред. Такие способы могут позволить антитела к быть подвергнуты скринингу в биологически соответствующих анализов, например, рецептор-опосредованной интернализации антитела анализа в случае с АЦП. Здесь мы опишем метод (по-бусинки) метод, который позволяет маркировать небольших количеств антител непосредственно из клеточных сред. Этот подход использует большой емкости магнитного белка А и белком G. сродства бусинки для захвата антителиз клеточных сред с последующей маркировки с малыми молекулами с использованием либо амин или тиол химию и последующее элюирование меченых антител. Принимая флуоресцентные красители в качестве суррогата для малых молекул, мы демонстрируем маркировку на-бусинки трех различных мышиных антител непосредственно из клеточных сред с использованием как амин и тиольную химию маркировки. Высокая аффинность связывания антител к белку А и белка G обеспечивает высокое извлечение, а также высокую степень чистоты меченых антител. Кроме того, использование магнитных гранул позволяет использовать несколько образцов, которые будут обрабатываться вручную, тем самым значительно улучшая мечения пропускную способность.

Введение

Антитела , меченные небольшими молекулами являются , пожалуй, наиболее часто используемые реагенты в биологии ^1,2. Антитела , меченные флуоресцентными красителями и биотин широко используются в визуализации, иммунологического анализа, проточной цитометрии, вестерн - блоттинга и иммунопреципитации среди других приложений ^3-6. Радиоактивно меченных ^3,7 находят широкое применение в визуализации и терапии, антител , меченных цитостатическими препаратами (АСДУ) предлагают новые возможности для лечения рака, и два АЦП уже одобрены для терапевтического применения ^8. Несмотря на широкое применение, методы для мечения антител остаются на удивление неизменными и обычно включают в себя несколько реакций и обессоливания шаги ^9-12. Методы решения работают очень хорошо в тех случаях, когда требуется помечать лишь несколько антител и доступны в высокоочищенной форме при высокой концентрации и в достаточных объемах. Тем не менее, для новых приложений, таких как АЦП, естьнеобходимо маркировать антитела на ранней стадии гибридом , так что они могут быть подвергнуты скринингу на биологически активные свойства, например, рецептор-опосредованный антителами интернализации ^13-16. На этапе гибридом, выборочные объемы ограничены, антитела экспрессируются в низких концентрациях, а также ряд образцов велики, следовательно, решение, основанное методы маркировки не подходят.

Чтобы упростить и улучшить пропускную способность традиционных методов маркировки антител, несколько альтернативных подходов были предложены ^17,18. Один из подходов состоит в использовании немагнитного белок сродства бусинки, упакованных в маленькие колонки для захвата антител с последующей реакцией с ярлыком и элюции меченого и очищенного белка. Этот метод может быть использован для обозначения антител непосредственно из клеточных сред, тем не менее, использование колонн может быть трудоемким. Метод , основанный магнитный шарик недавно сообщалось , что ¹⁹ исключает использование колонн и повышает пропускную способность, но из - зав ячейки антитела способность гранул, только нанограмм на низких микрограммных количеств антител, могут быть помечены.

Недавно мы разработали и использовали Высокая емкость магнитного белка А и белка G бусин (> 20 мг человеческого IgG / мл осевшие шарики) для обозначения антитела , присутствующие в клеточной среде с малыми молекулами ^20. Высокая емкость гранул позволяет десятков до сотен микрограммов антител помечать удобно и быстрое магнитный отклик гранул упрощает обработку и обработку большого числа образцов параллельно. Использование флуоресцентных красителей в качестве суррогата для малых молекул, мы покажем, что метод совместим с амином и тиоловой химии маркировки и предлагает высокое извлечение меченых и очень чистых антител.

Этот протокол и сопровождающий видео описывают по-бусинки мечение мышиных антител, присутствующих в средах клеток с использованием магнитных белка A и протеин G-бусинки. Протоколразделен на четыре секции: Секция 1 описывает захват антител на шарик из биологических образцов. После захвата, маркировка антител с флуоресцентным красителем с использованием амина или химии с использованием тиоловой химии описана в разделах 2 и 3 секции соответственно. Наконец, в разделе 4 описывается метод для расчета концентрации антител и красителя соотношение антител.

протокол

1. Антитело Захват на высокой емкости Магнитный белок А или магнитно-протеин G-шариков

1. Равномерно повторно приостанавливать магнитные шарики осторожно встряхивая. Держите подвеска форму, когда аликвоты бусин.
2. Добавляют 50 мкл суспензии шарик до 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Место в магнитном стенде в течение 10 сек. Осторожно удалите буфер хранения.
3. Добавьте 250 мкл буфера для связывания антитела.
4. Смешайте и поместите в магнитный штатив в течение 10 сек. Осторожно удалите связывающий буфер.
5. Добавить 1,0 мл образца, содержащего 50-100 мкг антитела к шарикам. Образцы могут быть очищены антитела или антител в клеточных сред.
6. Смешайте образец в течение 60 мин при комнатной температуре, используя вихревой смеситель или конец поверх концевой смеситель.
7. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек и удалить супернатант.
8. Добавьте 250 мкл связывания антител / буфера для промывки и перемешать. Место в магнитный штатив на 10 сек и удалить связывания / промывочного буфера. Повторите это SТЭП в общей сложности двух стирок.
9. Перейдите к разделу 2 с антителами этикетки с использованием амина химии или в разделе 3 с антителами этикеток с использованием химии тиольную.

2. Мечение антитела с использованием Амин Химия

1. конъюгат антитела
   1. Добавьте 100 мкл буфера для конъюгации амина к шарикам.
   2. Растворите амином реактивная флуоресцентные красители (AlexaFluor 532-SE) в количестве 10 мг / мл путем добавления 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) до 1,0 мг красителя. Смешайте встряхиванием. Сделать это решение непосредственно перед использованием.
   3. Добавить 2,5 мкл аминного-реактивный краситель для 100 мкг антитела.
      Примечание: Как правило, 5-20 молярный избыток реакционноспособного красителя рекомендуется. Тем не менее, количество химически активного красителя добавляют в реакционную смесь должна быть эмпирически оптимизировано в зависимости от желаемого красителя соотношения антител и антител, присущих свойств.
   4. Смешайте образец в течение 60 мин при комнатной температуре, используя вихревой смеситель или конец поверх концевой смеситель. Убедитесь, что гранулы остаются в suspensioп.
   5. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек и удалить супернатант.
   6. Добавьте 250 мкл связывания антител / буфера для промывки и перемешать. Место в магнитном стенде в течение 10 сек. Удаляют связывающую / промывочный буфер. Повторите этот шаг в общей сложности на двух стирок.
2. Восстановление антителам
   1. Добавьте 50 мкл буфера для элюции с гранулами.
   2. Перемешивать в течение 5 мин при комнатной температуре, используя вихревой смеситель или конец поверх концевой смеситель. Убедитесь, что гранулы остаются в суспензии.
   3. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек. Удалить элюированный образец и переход на новую микро-центрифужную пробирку, содержащую 5 мкл нейтрализующего буфера.
   4. Повторите этот процесс еще раз и объединить Элюированные образцы.
   5. Количественной оценки концентрации антител и красителя к антитела отношение, как описано в разделе 4.

3. Антитело Этикетировочное Использование тиоловых химии

1. Снижение антител
   1. Добавить 250 мклтиоловой буфера сопряжением и смеси. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек. Снимите и выбросьте буфер. Повторите этот шаг дважды.
   2. Добавьте 100 мкл буфера тиоловой сопряжением.
   3. Добавить дитиотрептол (DTT) до конечной концентрации 2,5 мМ.
   4. Смешайте образец в течение 60 мин при комнатной температуре, используя вихревой смеситель или конец поверх концевой смеситель. Убедитесь, что гранулы остаются в суспензии.
   5. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек и отбросить буфера.
   6. Добавить 250 мкл буфера тиоловой сопряжением и перемешать. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек. Снимите и выбросьте буфер. Повторите этот шаг в общей сложности на двух стирок.
   7. Добавьте 100 мкл буфера тиоловой сопряжением.
2. конъюгат антитела
   1. Растворите тиольные реактивный краситель в количестве 10 мг / мл путем добавления 100 мкл ДМСО до 1,0 мг красителя. Смешайте встряхиванием. Сделать это решение непосредственно перед использованием.
   2. Добавить 2,5 мкл тиол-реактивного красителя для 100 мкг антикорпус.
      Примечание: Как правило, 5-20 молярный избыток реакционноспособного красителя рекомендуется. Тем не менее, количество химически активного красителя добавляют в реакционную смесь должна быть эмпирически оптимизировано в зависимости от желаемого красителя соотношения антител и антител, присущих свойств.
   3. Смешайте образец в течение 60 мин при комнатной температуре, используя вихревой смеситель или конец поверх концевой смеситель. Убедитесь, что гранулы остаются в суспензии.
   4. Поместите пробирку в магнитный штатив на 10 сек и удалить супернатант.
   5. Добавить 250 мкл буфера тиоловой сопряжением и перемешать. Место в магнитном стенде в течение 10 секунд и удалите буфер. Повторите этот шаг в общей сложности на двух стирок.
3. Элюировать антителам
   1. Добавьте 50 мкл буфера для элюции с гранулами.
   2. Перемешивать в течение 5 мин при комнатной температуре, используя вихревой смеситель или конец поверх концевой смеситель. Убедитесь, что гранулы остаются в суспензии.
   3. Поместите пробирку в магнитный штатив в течение 10 сек. Удалить элюированный образец и переход на новую микро-центрифужную пробирку, содержащую 5 мкл NEUTralization буфера.
   4. Повторите этот процесс еще раз и объединить Элюированные образцы.
   5. Количественной оценки концентрации антител и красителя к антитела отношение, как описано в разделе 4.

Соотношение 4. Вычислить Dye к антителам

1. Измеряют поглощение конъюгата антитело-краситель при 280 нм (А280) и при & lambda; max для красителя (Amax).
2. Вычислить концентрацию антител:
   Антитело Концентрация (мг / мл) = A280 - (A _макс × CF) / 1,4
   где CF = Коэффициент коррекции красителя (предоставленного производителем).
3. Рассчитать отношение красителя к-антитела:
   Краситель к Антитело Соотношение (DAR) = (A _макс × 150000) / Ab Концентрация (мг / мл) × ε _{краситель}
   где ε = _{красителем} коэффициент поглощения красителя в максимуме поглощения и молекулярная масса антитела = 150000 Da.

Результаты

Схема для мечения антител с малыми молекулами с использованием высокой емкости магнитного белка А и белка G бусин показано на рисунке 1. Антитела , снятые на магнитном Protein G гранулы могут быть помечены с малыми молекулами, например , флуоресцентные красители, с...

Обсуждение

Цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать способ маркировать антитела, присутствующие в средствах массовой информации клеток при низких концентрациях, с различными малыми молекулами. Такой способ позволит большое количество антител, во время ранней стадии обнаруже...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magne Protein A Beads	Promega Corporation	G8781
Magne Protein G Beads	Promega Corporation	G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)	Life Technologies	A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)	Life Technologies	A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)	Life Technologies	A20347
Fluorescein-ME (Maleimide)	Life Technologies	F-150
Magnetic Stand	Promega	Z5332