תיוג נוגדן עם צבעי ניאון באמצעות חלבון מגנטי חלבון G חרוזים

Summary

השיטה על-חרוז תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות מאפשרת סימון של כמות קטנה של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטה זו תואמת אמין וכימית תיאול, ואת יכולה להתמודד עם דגימות מרובות במקביל, באופן ידני או באמצעות פלטפורמות אוטומטיות.

Abstract

נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות כמו צבעי ניאון, תרופות ציטוטוקסיות קליעים נותבים רדיואקטיביים הם כלים חיוניים במחקר ביו, immunodiagnostics ולאחרונה כסוכנים טיפוליים. שיטות מסורתיות נוגדני תיוג עם מולקולות קטנות דורשות מטוהרי נוגדנים בריכוז גבוה יחסית, כרוכות צעדי דיאליזה מרובות מוגבלות תפוקה. עם זאת, מספר יישומים, כוללים בתחום הנוגדן ותרופות conjugates (ADC), ייהנו שיטות חדשות שתאפשרנה תיוג של נוגדנים ישירות תקשורת תא. שיטות אלה עשויות לאפשר נוגדנים שיוקרו מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, למשל, assay הפנמת נוגדן קולטן בתיווך במקרה של ממירי ADC. כאן, אנו מתארים שיטה (על-חרוז) שיטה המאפשרת תיוג של כמויות קטנות של נוגדנים ישירות תקשורת תא. גישה זו משתמשת חלבון מגנטי קיבולת גבוהה חלבון זיקת G חרוז ללכוד נוגדניםמתקשורת התא ואחריו תיוג עם מולקולות קטנות או באמצעות אמין או כימית תיאול ו elution הבאה של הנוגדנים שכותרתו. אם ניקח צבעי ניאון כמו תחליפים עבור מולקולות קטנות, אנחנו מדגימים את התוויות על-חרוז של שלושה נוגדנים שונים עכבר ישירות מהמדיה תא באמצעות שני אמין וכימית תיוג תיאול. הזיקה מחייבת נוגדנים הגבוהה לחלבון וחלבון G מבטיחה החלמה גבוהה, כמו גם טוהר גבוה של הנוגדנים שכותרתו. בנוסף, שימוש חרוז מגנטיים מאפשר דגימות מרובות כדי להיות מטופלים באופן ידני, ובכך לשפר את תפוקת תיוג משמעותי.

Introduction

נוגדנים שכותרתו עם מולקולות קטנות הם אולי ריאגנטים הנפוצים ביותר ^1,2 ביולוגיה. נוגדנים שכותרתו עם צבעי ניאון ו ביוטין נמצאים בשימוש נרחב בתחום ההדמיה, immunoassays, cytometry זרימה, כתמים מערביים, ו immunoprecipitation בין יישומים אחרים ^3-6. נוגדני radiolabeled ^3,7 למצוא שימוש נרחב בתחום הדמית טיפול, נוגדנים שכותרתו עם תרופות ציטוטוקסיות (ADC) מציעים אפשרויות חדשות לטיפול הסרטן, ושני ממירים ADC שכבר אושרו לשימוש טיפולי ^8. למרות השימוש הנרחב שלהם, שיטות נוגדני תיוג נותרו ללא שינוי מפתיע ובדרך כלל כרוכות תגובות מרובות desalting שלבי ^9-12. שיטות פתרון היטב לשימוש במקרים בם רק כמה נוגדנים צריכים להיות מתויגים והם זמינים בצורה נקיה במיוחד בריכוז גבוה בהיקפי מספיק. עם זאת, עבור יישומים חדשים יותר כמו ממירי ADC, קייםצריך לתייג נוגדנים בשלב hybridoma מוקדם כדי שיוכלו להיות מוקרן על תכונות רלוונטיות מבחינה ביולוגית, למשל, ^13-16 הפנמת נוגדן קולטן בתיווך. בשלב hybridoma, כרכי מדגם מוגבלים, הנוגדנים באים לידי ביטוי בריכוזים נמוכים ומספר דגימות גדולות, ומכאן שיטות תיוג מבוסס פתרון אינן מתאימות.

כדי לפשט ולשפר את התפוקה של שיטות תיוג נוגדן המסורתיות, כמה גישות חלופיות הוצעו ^17,18. גישה אחת היא להשתמש חלבון שאינו מגנטי חרוזים זיקה ארוזים עמודים קטנים ללכוד נוגדנים ואחריו התגובה תיוג ו elution של חלבון הנקרא וטיהר. שיטה זו יכולה לשמש כדי לתייג נוגדנים ישירות תקשורת תא, לעומת זאת, השימוש בעמודים יכול להיות מייגע. שיטה מגנטית חרוז מבוססת לאחרונה דווחה ¹⁹ זה מבטל את השימוש בעמודים משפר את התפוקה אך בשלכדי הנוגדן המוגבל יכולת קשירה של החרוזים, רק ננוגרם לכמויות מיקרוגרם נמוכים של הנוגדנים יכול להיות מתויג.

פתחנו לאחרונה והשתמשנו קיבולת גבוהה חלבון מגנטי חלבון G חרוזים (> 20 מ"ג של IgG אדם / מיליליטר של חרוזים מיושבים) לתייג נוגדנים נוכחיים בתקשורת תא עם מולקולות קטנות ^20. הקיבולת הגבוהה של החרוזים מאפשרת עשרות עד מאה מיקרוגרם של נוגדנים להיות מתויגות בנוחות התגובה המגנטית המהירה של חרוזי מפשט טיפול ועיבוד של מספר רב של דגימות במקבילות. באמצעות צבעי ניאון כמו התחליפים עבור מולקולות קטנות, אנו מראים כי השיטה תואמת כימיה תיוג אמין ו תיאול ומציע החלמה גבוה של נוגדנים שכותרתו מאוד טהור.

פרוטוקול זה ואת הסרטון מלווה לתאר תיוג על-חרוז של נוגדני העכבר נוכחיים בתקשורת התא באמצעות חלבון מגנט חלבון G חרוזים. הפרוטוקול הואלארבעה חלקים מחולקים: סעיף 1 מתאר את לכידתו של נוגדנים על החרוז מ דגימות ביולוגיות. בעקבות לכיד, התיוג של נוגדנים עם צבע פלואורסצנטי באמצעות כימיה אמינה או באמצעות כימית תיאול מתואר בסעיפים 2 וסעיף 3, בהתאמה. לבסוף, סעיף 4 מתאר את השיטה לצורך החישוב של ריכוז נוגדנים ואת צבע יחס נוגדן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. לכידת נוגדן על בקיבולת גבוהה חלבון מגנטי או חלבון מגנטי חרוזים G

1. באופן אחיד מחדש להשעות חרוזים מגנטיים ידי רעד עדין. שמור את מדי השעיה כאשר aliquoting חרוזים.
2. הוסף 50 μl של slurry חרוז צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. מקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. מוציאים בזהירות את למאגר אחסון.
3. הוסף 250 μl של חיץ נוגדן מחייב.
4. מערבבים ומניחים לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. מוציאים בזהירות את חיץ מחייב.
5. להוסיף 1.0 מ"ל של מדגם המכיל 50-100 מיקרוגרם של נוגדנים חרוזים. דוגמאות ניתן מטוהרים נוגדנים או נוגדנים בתקשורת תא.
6. מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה.
7. מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant.
8. הוסף 250 μl של חיץ מחייב / כביסה נוגדן ומערבבים. המקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר חיץ מחייב / כביסה. חזור על פעולה זו sTEP עבור סכום כולל של שני שוטף.
9. המשך לסעיף 2 לנוגדני תווית באמצעות כימיה אמינה או סעיף 3 לנוגדני תווית באמצעות כימית תיאול.

2. תיוג נוגדן שימוש אמין לכימיה

1. המצומד נוגדן
   1. הוספת 100 μl של חיץ נטיה אמין אל חרוזים.
   2. ממיסים את צבעי ניאון-reactive אמין (AlexaFluor 532-SE) ב 10 מ"ג / מ"ל ​​על ידי הוספת 100 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO) ל -1.0 מ"ג של צבע. מערבבים על ידי vortexing. בצע פתרון זה רק לפני השימוש.
   3. להוסיף 2.5 μl של צבע אמין-פעיל 100 מיקרוגרם של הנוגדן.
      הערה: בדרך כלל עודפת 5-20 טוחן של צבע תגובתי מומלצת. עם זאת, כמות של צבע תגובתי להוסיף התגובה צריכה להיות מותאמת באופן אמפירי בהתאם לצבוע רצוי יחס נוגדן ומאפייני נוגדן מהותיים.
   4. מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי החרוזים להישאר suspension.
   5. מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant.
   6. הוסף 250 μl של חיץ מחייב / כביסה נוגדן ומערבבים. מקום לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק חיץ מחייב / כביסה. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף.
2. שחזור נוגדן
   1. הוסף 50 μl של חיץ elution על חרוזים.
   2. מערבבים במשך 5 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף.
   3. מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. הסר מדגם eluted ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות חדש המכיל 5 μl של חיץ הניטרול.
   4. חזור על התהליך עוד פעם אחת לרכז את דגימות eluted.
   5. לכמת את ריכוז הנוגדנים לצבוע-אל-נוגדן יחס כמפורט בסעיף 4.

3. תיוג נוגדן שימוש תיאול לכימיה

1. הפחתת נוגדן
   1. הוסף 250 μlשל חיץ ותמהיל נטיה תיאול. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק למאגר. חזור על פעולה זו פעמיים.
   2. הוספת 100 μl של חיץ נטיה תיאול.
   3. להוסיף Dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 2.5 מ"מ.
   4. מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף.
   5. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות וזורקים חיץ.
   6. הוסף 250 μl של חיץ נטיה תיאול ומערבבים. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. סר וזורק למאגר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף.
   7. הוספת 100 μl של חיץ נטיה תיאול.
2. המצומד נוגדן
   1. ממיסים את צבען תיאול-reactive ב 10 מ"ג / מ"ל ​​על ידי הוספת 100 μl של DMSO ל -1.0 מ"ג של צבע. מערבבים על ידי vortexing. בצע פתרון זה רק לפני השימוש.
   2. להוסיף 2.5 μl של צבע תיאול-פעיל 100 מיקרוגרם של אנטיגוּף.
      הערה: בדרך כלל עודפת 5-20 טוחן של צבע תגובתי מומלצת. עם זאת, כמות של צבע תגובתי להוסיף התגובה צריכה להיות מותאמת באופן אמפירי בהתאם לצבוע רצוי יחס נוגדן ומאפייני נוגדן מהותיים.
   3. מערבבים מדגם למשך 60 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף.
   4. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות ולהסיר supernatant.
   5. הוסף 250 μl של חיץ נטיה תיאול ומערבבים. מקום לעמוד מגנטי במשך 10 שניות ולהסיר למאגר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שני שוטף.
3. Elute נוגדן
   1. הוסף 50 μl של חיץ elution על חרוזים.
   2. מערבבים במשך 5 דקות ב RT בעזרת מערבל מערבולת או מערבל הקצה על הקצה. ודא כי חרוזים לרחף.
   3. מניח צינורית לעמוד המגנטי במשך 10 שניות. הסר מדגם eluted ולהעביר צינור מיקרו צנטריפוגות חדש המכיל 5 μl של neutחיץ ralization.
   4. חזור על התהליך עוד פעם אחת לרכז את דגימות eluted.
   5. לכמת את ריכוז הנוגדנים לצבוע-אל-נוגדן יחס כמפורט בסעיף 4.

4. חישוב יחס צבען אל-נוגדן

1. מדוד את הספיגה של המצומד הנוגדן-צבען ב 280 ננומטר (A280) ובבית λmax עבור הצבע (אמקס).
2. חשבתי את ריכוז הנוגדן:
   ריכוז נוגדן (מ"ג / מ"ל) = A280 - _{(מקסימום} × CF) / 1.4
   איפה CF = תיקון גורם של הצבע (המסופק על ידי היצרן).
3. חשב את יחס צבען אל-נוגדן:
   צבען אל-נוגדן יחס (DAR) = (A _max × 150,000) / ריכוז Ab (מ"ג / מ"ל) × ε _לצבוע
   שם, _לצבוע ε = מקדם הכחדה של צבע במקסימום ספיגת שלה ועל משקל מולקולרי של נוגדן = 150,000 דא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סכימטי תיוג נוגדנים עם מולקולות קטנות באמצעות חלבון מגנטי גבוהה קיבולת חלבון G חרוזים מוצג באיור 1. נוגדנים שנתפסו על חרוזים המגנטי החלבון G יכולים להיות מתויגים עם מולקולות קטנות, עבור צבעי ניאון למשל, באף אחת כימיה אמינה אשר תוויות אמינים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה לתייג נוגדנים, נוכח בתקשורת התא בריכוזים נמוכים, עם מגוון רחב של מולקולות קטנות. שיטה כזו תאפשר מספר רב של נוגדנים, בשלבים הראשונים של גילוי נוגדנים, כדי להיות מתויגת עם מולקולות קטנות, ובדרך הוקרנה באמצעות assay רלוונטית מבחינה ביולוג?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magne Protein A Beads	Promega Corporation	G8781
Magne Protein G Beads	Promega Corporation	G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)	Life Technologies	A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)	Life Technologies	A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)	Life Technologies	A20347
Fluorescein-ME (Maleimide)	Life Technologies	F-150
Magnetic Stand	Promega	Z5332