Rotulagem de anticorpos com corantes fluorescentes utilizando proteína Magnetic A e esferas de proteína G

Resumo

O método no grânulo para a marcação de anticorpos com pequenas moléculas permite a marcação de uma pequena quantidade de anticorpos directamente a partir de meio celular. Este método é compatível com a química de amina e tiol, e pode lidar com várias amostras em paralelo, manualmente ou por meio de plataformas automatizadas.

Resumo

Anticorpos marcados com pequenas moléculas como corantes fluorescentes, medicamentos citotóxicos e traçadores radioativos são ferramentas essenciais na investigação biomédica, imunodiagnóstico e, mais recentemente como agentes terapêuticos. Os métodos tradicionais de anticorpos de rotulagem com pequenas moléculas requerem anticorpos purificados na concentração relativamente elevada, envolvem múltiplos passos de diálise e tem produção limitada. No entanto, várias aplicações, incluindo o campo de Anticorpo drogas conjugados (ADCs), irão beneficiar de novos métodos que permitam a rotulagem de anticorpos diretamente da mídia de celulares. Tais métodos podem permitir que os anticorpos a serem rastreados em ensaios biologicamente relevantes, por exemplo, o ensaio de anticorpo de internalização mediada pelo receptor no caso de ADCs. Aqui, nós descrevemos um (método a-bead) método que permita a marcação de pequenas quantidades de anticorpos directamente a partir de meio celular. Esta abordagem utiliza alta capacidade G esferas de afinidade Protein magnética A e proteína para capturar anticorposa partir dos meios celulares, seguido de marcação com moléculas pequenas utilizando quer química de amina ou de tiol e a subsequente eluição dos anticorpos marcados. Tomando corantes fluorescentes como substitutos para moléculas pequenas, que demonstram a rotulagem sobre-cordão de três diferentes anticorpos de ratinho directamente a partir de meios celulares utilizando tanto amina e química rotulagem tiol. A elevada afinidade de ligação de anticorpos à proteína A e proteína G assegura recuperações elevadas, bem como elevada pureza dos anticorpos marcados. Além disso, a utilização de esferas magnéticas permite que amostras múltiplas para serem manuseados manualmente, melhorando desse modo significativamente a taxa de transferência de rotulagem.

Introdução

Os anticorpos marcados com moléculas pequenas são, talvez, os reagentes mais utilizados na biologia ^1,2. Os anticorpos marcados com corantes fluorescentes e biotina são amplamente utilizados em imagiologia, imunoensaios, citometria de fluxo, Western blot, imunoprecipitação e entre outras aplicações ^3-6. Anticorpos radiomarcados ^3,7 encontrar o uso extensivo em imagiologia e terapia, anticorpos marcados com drogas citotóxicas (ADCs) estão oferecendo novas opções para o tratamento de cancros, e dois ADCs já foram aprovados para uso terapêutico ^8. Apesar de sua ampla utilização, os métodos para detecção de anticorpos rotulagem continuam surpreendentemente inalterado e normalmente envolvem múltiplas reações e dessalinização os passos ^9-12. métodos de solução funciona muito bem nos casos em que apenas alguns anticorpos necessita ser etiquetado e estão disponíveis em forma altamente purificada em concentração elevada e em volumes suficientes. No entanto, para aplicações mais recentes, como os ADCs, existe umprecisa para marcar anticorpos de hibridoma na fase precoce de modo que eles podem ser rastreados para propriedades biologicamente relevantes, por exemplo, mediada por receptor de anticorpos de internalização ^13-16. Na fase de hibridoma, os volumes de amostra são limitados, os anticorpos são expressas em baixas concentrações e uma série de amostras são grandes, portanto, solução baseada em métodos de marcação não são adequados.

Para simplificar e melhorar o rendimento dos métodos de rotulagem de anticorpos tradicionais, algumas abordagens alternativas têm sido propostas ^17,18. Uma abordagem é a utilização de proteínas de não-magnético grânulos de afinidade embalados em pequenas colunas para capturar anticorpos, seguido pela reacção de marcação e a eluição da proteína marcada e purificada. Este método pode ser utilizado para rotular os anticorpos directamente a partir de meios de células, no entanto, o uso de colunas pode ser trabalhoso. Processo baseado em esférulas magnéticas tem sido relatado recentemente que ¹⁹ elimina o uso de colunas e melhora o rendimento mas devidopara o anticorpo limitada capacidade dos grânulos de ligação, apenas a nanograma a baixas quantidades de micrograma de os anticorpos podem ser marcados.

Nós recentemente desenvolvido e utilizado alta capacidade magnética Proteína A e Proteína G grânulos (> 20 mg de IgG humana / mL de esferas de liquidados) para rotular anticorpos presentes nos meios de células com moléculas pequenas ^20. A elevada capacidade dos grânulos permite dezenas a centenas de microgramas de anticorpo a ser marcado convenientemente e a resposta magnética rápida dos grânulos simplifica o manuseamento e processamento de um grande número de amostras em paralelo. Utilizando corantes fluorescentes como substitutos para moléculas pequenas, que mostram que o método é compatível com a amina e tiol rotulagem química e oferece recuperações elevadas de anticorpos marcados e muito puras.

Este protocolo eo vídeo que a acompanha descrevem rotulagem on-gota de anticorpos de ratinho presentes nos meios de células usando G esferas de Proteína Magnetic A e proteína. O protocolo édividida em quatro secções: uma secção descreve a captura de anticorpos para o grânulo a partir de amostras biológicas. Após a captura, a rotulagem de anticorpos com corante fluorescente usando química amina ou utilizando a química do tiol é descrito nas Secções 2 e seção 3, respectivamente. Finalmente, a seção 4 descreve o método para o cálculo da concentração de anticorpos e o corante à relação de anticorpos.

Protocolo

1. Captura de Anticorpos em G Beads Alta Capacidade Protein Magnetic A ou a proteína Magnetic

1. Uniformemente re-suspender as esferas magnéticas por agitação suave. Mantenha o uniforme de suspensão quando alíquotas esferas.
2. Adicionar 50 ul de suspensão de esferas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque no suporte magnético por 10 s. Retire cuidadosamente o tampão de armazenamento.
3. Adicionar 250 ul de tampão de ligação do anticorpo.
4. Misture e coloque no suporte magnético por 10 s. Retire cuidadosamente o tampão de ligação.
5. Adicionar 1,0 ml de amostra contendo 50-100 ng de anticorpo com as esferas. As amostras podem ser purificados anticorpos ou anticorpos no meio celular.
6. Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final.
7. Coloque tubo no suporte magnético por 10 seg e remover o sobrenadante.
8. Adicionar 250 ul de anticorpo tampão de ligação / lavagem e misturar. Coloque no suporte magnético por 10 seg e remover o tampão de ligação / lavagem. Repita este step para um total de duas lavagens.
9. Vá para a Seção 2 a anticorpos etiqueta utilizando química amina ou a Seção 3 para anticorpos etiqueta utilizando química tiol.

2. Rotulagem de anticorpos utilizando a amina Química

1. conjugado anticorpo
   1. Adicionar 100 ul de tampão de conjugação de amina para os grânulos.
   2. Dissolver os corantes fluorescentes reactivos com aminas (AlexaFluor 532-SE) a 10 mg / ml por adição de 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1,0 mg de corante. Misture em vortex. Faça esta solução imediatamente antes da utilização.
   3. Adicionar 2,5 mL de corante reactivo a amina de 100 ug de anticorpo.
      Nota: normalmente um excesso molar de 5-20 de corante reactivo é recomendado. No entanto, a quantidade de corante reactivo adicionado à reacção tem de ser empiricamente optimizadas dependendo do corante desejado rácio de anticorpos e propriedades intrínsecas de anticorpos.
   4. Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspension.
   5. Coloque tubo no suporte magnético por 10 seg e remover o sobrenadante.
   6. Adicionar 250 ul de anticorpo tampão de ligação / lavagem e misturar. Coloque no suporte magnético por 10 s. Remova e descarte tampão de ligação / lavagem. Repetir esta etapa para um total de duas lavagens.
2. Recuperação de anticorpo
   1. Adicionar 50 ul de tampão de eluição para os grânulos.
   2. Mistura-se durante 5 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
   3. Coloque tubo no suporte magnético por 10 s. Remover a amostra e eluiu-se a transferência para um tubo de micro-centrifugação novo contendo 5 ul de tampão de neutralização.
   4. Repetir o processo mais uma vez e reunir as amostras eluídas.
   5. Quantificar a concentração de anticorpos e tingir-se anticorpo rácio conforme descrito na Seção 4.

3. Anticorpo de marcação utilizando química Tiol

1. Redução de anticorpo
   1. Adicionar 250 ulde tampão de conjugação de tiol e mistura. Colocar o tubo no suporte magnético durante 10 seg. Retirar e descartar o buffer. Repita esta etapa duas vezes.
   2. Adicionar 100 ul de tampão de conjugação de tiol.
   3. Adicionar ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 2,5 mM.
   4. Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
   5. Colocar o tubo no suporte magnético durante 10 seg e descartar o tampão.
   6. Adicionar 250 ul de tampão de conjugação de tiol e misturar. Colocar o tubo no suporte magnético durante 10 seg. Retirar e descartar o buffer. Repetir esta etapa para um total de duas lavagens.
   7. Adicionar 100 ul de tampão de conjugação de tiol.
2. conjugado anticorpo
   1. Dissolve-se o corante reactivo com tiol a 10 mg / ml por adição de 100 ul de DMSO a 1,0 mg de corante. Misture em vortex. Faça esta solução imediatamente antes da utilização.
   2. Adicionar 2,5 mL de corante reactivo com tiol de 100 ug de anticorpo.
      Nota: normalmente um excesso molar de 5-20 de corante reactivo é recomendado. No entanto, a quantidade de corante reactivo adicionado à reacção tem de ser empiricamente optimizadas dependendo do corante desejado rácio de anticorpos e propriedades intrínsecas de anticorpos.
   3. Misturar amostras durante 60 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
   4. Coloque o tubo no suporte magnético por 10 seg e remover o sobrenadante.
   5. Adicionar 250 ul de tampão de conjugação de tiol e misturar. Coloque no suporte magnético por 10 segundos e retire o tampão. Repetir esta etapa para um total de duas lavagens.
3. eluto Antibody
   1. Adicionar 50 ul de tampão de eluição para os grânulos.
   2. Mistura-se durante 5 min à temperatura ambiente usando um misturador de vórtice ou misturador-sobre-extremidade final. Certifique-se que as contas permanecem em suspensão.
   3. Coloque tubo no suporte magnético por 10 s. Remover amostra eluída e transferir para um tubo de micro-centrífuga nova contendo 5 ul de neuttampão ralization.
   4. Repetir o processo mais uma vez e reunir as amostras eluídas.
   5. Quantificar a concentração de anticorpos e tingir-se anticorpo rácio conforme descrito na Seção 4.

Rácio 4. Calcule Dye-to-Antibody

1. Medir a absorvância do conjugado anticorpo-corante a 280 nm (A280) e a ^ max para o corante (Amax).
2. Calcula-se a concentração de anticorpo:
   Concentração de anticorpo (mg / ml) = A 280 - (A _máx × CF) / 1.4
   em que CF = factor de correcção do corante (fornecido pelo fabricante).
3. Calcular a proporção de corante-de-anticorpo:
   Tintura-se Anticorpo Ratio (DAR) = (A _máx 150000 ×) / Ab Concentração (mg / ml) × ε _corante
   onde, _corante ε = o coeficiente de extinção do corante no seu máximo de absorvância e o peso molecular do anticorpo = 150000 Da.

Resultados

Um esquema para a marcação de anticorpos com moléculas pequenas utilizando G grânulos alta capacidade Proteína magnética A e proteína é mostrada na Figura 1. Os anticorpos capturados sobre a proteína magnética grânulos G podem ser marcados com moléculas pequenas, por exemplo, corantes fluorescentes, utilizando quer química de amina que rotula aminas primárias de ácidos aminados ou da lisina utilizando química de tiol, o qual etiquetas nos tióis reduzidos...

Discussão

O objectivo deste estudo foi o de desenvolver um método para marcar anticorpos, presentes no meio celular em baixas concentrações, com uma variedade de moléculas pequenas. Um tal processo permitirá que um grande número de anticorpos, durante as fases iniciais da descoberta de anticorpos, para ser marcado com moléculas pequenas e rastreados utilizando um ensaio de biologicamente relevante. Um desses ensaios é o ensaio de anticorpo de internalização mediada pelo receptor onde internalização pode variar entre o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magne Protein A Beads	Promega Corporation	G8781
Magne Protein G Beads	Promega Corporation	G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)	Life Technologies	A20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)	Life Technologies	A10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimide)	Life Technologies	A20347
Fluorescein-ME (Maleimide)	Life Technologies	F-150
Magnetic Stand	Promega	Z5332