一个简单的荧光试验犬中性粒细胞胞外陷阱里放的量化

摘要

中性粒细胞胞外陷阱（英语教师）是DNA，组蛋白和中性粒细胞的蛋白质网络。虽然先天免疫反应的一个组成部分，母语有牵连的自身免疫和血栓形成。这个协议描述了犬嗜中性粒细胞的分离和使用微板荧光测定教师的量化的简单方法。

摘要

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

引言

有超过7000万只宠物狗在美国独自^1。为尊贵的家族成员，这些动物经常收到尖端的医疗护理。同样，因为他们分享我们的环境，狗可以提供深入了解人类疾病¹的发病机理和治疗。然而，无论是在人类医学成兽医治疗或反之亦然翻译的发现，它彻底表征即使在高度保守的系统种类的变化，例如先天免疫应答是重要的。的犬和人先天免疫系统之间的差异例子包括中性粒细胞的狗²高表达CD4;缺乏胞质鞭毛传感器IPAF犬³功能同系物的和在食肉动物⁴胱天蛋白酶1/4混合的表达。

中性粒细胞胞外陷阱（英语教师）是先天免疫⁵的相对最近发现的组成部分。篮网是网络S IN响应释放到大范围炎性或传染性刺激⁶的DNA的核和颗粒状蛋白质。网状结构已被证实在许多物种包括鸡^7，鱼^8，软体动物⁹和acoelomates ^10，但也有物种变体。例如，嗜中性粒细胞的小鼠更响应缓慢NETosis刺激比人类嗜中性粒细胞，形成弥漫性减弱英语教师^11。有一个庞大的身躯从多个物种蚊帐坑害微生物和更具争议可以直接参与杀灭病原体^12,13证据。然而，.NET组件也增强了组织的损伤，促进血栓形成，并作为自身抗原^14,15。教师的有益和有害作用之间的平衡可能不同的疾病和不同物种之间变化，这表明，调查无论是在物种和感兴趣条件母语是重要的。

在这里，我们描述了诱导和中性粒细胞犬测量母语释放一个简单的协议。此方法类似于那些用于分离嗜中性粒细胞¹⁶和在其他物种中诱发NETosis，但如激动剂浓度和温育时间条件已为犬嗜中性粒细胞进行了优化。类似的NET定量的DNA释放测定也已在其它物种中描述，但这里介绍的方法也为狗^8,17,18优化。

研究方案

所有实验均来自爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会批准伦理进行。

1.采血车

1. 绘制的9ml血从隐，头或颈静脉直接进入抗凝剂（ 例如，乙二胺四乙酸（EDTA），1.8毫克_的 K ₂ EDTA /毫升血）真空采血管，或与直接传送到含有EDTA的血液管的注射器。轻轻摇动或反转血管，以确保血液和抗凝血剂的充分混合。

2.中性粒细胞隔离

1. 在50ml锥形管中，用等体积的无菌室温度的混合血3％葡聚糖-500（0.9％无菌盐水组成）轻轻翻转。留在室温下直立18-20分钟。的稻草色上层转移到一个新的试管，直至其不再能够不污染由下红色层收集。在日红细胞Ë原管可被丢弃。
2. 离心上清在500 xg离心在4℃下10分钟。抽出并丢弃上清液。手动重新悬浮在10毫升室温的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）细胞沉淀。注意，涡旋不应该被用来在这个协议中的任何阶段重新悬浮中性粒细胞。手工绘制关闭，而不是浇灭上清还建议在整个协议以最大限度地提高细胞产量。
3. 10毫升室温多聚蔗糖和泛影酸钠细胞分离溶液（ 例如 ，的Histopaque 1077）添加到50毫升锥形管中。小心层在细胞分离溶液中的含细胞溶液。注意这并没有平衡到室温可减少细胞产量，使用细胞分离溶液。
4. 离心在300×g离心在室温下与制动切断30分钟。
5. 嗜中性粒细胞是在梯度的最低层，抽出并丢弃UPPER 3层，血浆和血小板，单核细胞的窄的白色带和密度梯度介质的透明层的上层的构成。
6. 以溶解任何残留的红细胞，再悬浮在10毫升室温的水中的嗜中性粒细胞颗粒。
7. 30秒后，通过加入10ml的无菌室温1.8％氯化钠恢复张力和轻轻地倒转混合。
8. 离心机在500×g离心在4℃下5分钟。抽出上清液并丢弃。
9. 如果丸粒仍然是红色，重复裂解步骤。如果颗粒是白色的（或者如果裂解已经执行两次），轻轻地在10ml无菌PBS重新悬浮细胞。
10. 计数使用自动计数器或血球细胞。典型产量是每毫升血液中的至少10 ^6个细胞。
11. 离心机在500×g离心在4℃下5分钟。抽出上清液并丢弃。
12. 重新悬浮细胞在无菌室温PBS中所需的浓度。佛r中的DNA释放测定在第2节以每毫升5×10 ^6个细胞中所述，重悬。
13. 如果需要的话，直接转移细胞的一小体积或使用cytocentrifuge到载玻片。允许细胞干燥并使用根据制造商的指令的快速固定和染色试剂盒染色。如果在显微镜下观察的嗜中性粒细胞分离已经成功，有核细胞的至少95％应是粒细胞（嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞）以最小的红细胞的污染。

3. DNA释放分析

1. 中性粒细胞后，立即隔离设立DNA释放试验。
2. 如果细胞聚集存在于原液通过光学显微镜检查，立即设置在测定前通过无菌70微米无菌过滤器通过细胞悬浮液。
3. 到无菌的96孔板的每个测试孔中，加入5×10 ^4个细胞/孔;激动剂和罗斯威尔公园备忘录不含酚红和补充有0.5％热灭活的胎牛血清100-200微升的最终体积里亚尔研究所-1640（RPMI）培养基。包括其中的中性粒细胞原液是由等体积的PBS替换每激动剂至少两个空白孔。注意，对于每个激动剂设置空白孔是在通过用荧光测定激动剂排除激动剂或干扰的DNA污染重要。
4. 孵育在39℃下，在二氧化碳（4％）培养箱中30分钟。
5. 在所需的浓度和细胞不可渗透的核酸染料添加激动剂。注意细胞不可渗透的染料的最佳浓度将不同的核酸染料之间变化。其中激动剂由等体积的培养基代替非刺激对照应包括在每个实验。
   注意:所希望的是稀释在培养基中的类似体积的激动剂保持孔之间是一致的条件。 200最终也卷＆＃181; l已成功使用，如果这个被改变，以及量应保持在所有条件相同。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（最终浓度≥0.1微米）或血小板活化因子（PAF）（最终浓度≥31微米）可被用作阳性对照。激动剂应至少一式两份进行测定。
6. 孵育在39℃。用酶标仪在2小时后，或在所需的时间间隔测量荧光。需要注意的是最佳的时间间隔将与所用激动剂而变化。
   注:波长将依赖于所用的染料。
7. 计算平均荧光之前减去空白荧光。
8. 允许个人之间以及板之间的比较，由非刺激孔的平均荧光除以刺激孔的平均荧光计算荧光的倍数变化。

结果

使用该协议，应该有在荧光与阳性对照，PMA和PAF刺激嗜中性粒细胞后强烈的倍数变化。如在图1B中 ，犬嗜中性粒细胞的刺激所示用31微米的PAF 1小时的结果，平均4.0倍的增加的荧光与未刺激细胞（范围2.0-5.8中，n = 5只犬^）18进行比较。 PMA在0.1微米（ 图1A）是较慢激动剂不导致荧光的增加，直到2小时，但最终会产生荧光的类似倍的增加（平?...

讨论

提出的DNA释放法是外DNA一个容易量化分析。该方法改编自用于评估其他物种NET形成类似的技术，但离心速度，激动剂浓度和温育时间已被改变，以优化使用的方法与犬粒细胞^8,17,18。类似的调整可以作出适应其他物种的方法。当与其他方法测量NETosis如流式细胞术或图像分析相比，该法是简单又便宜。该方法也并不需要对.NET组件抗体，所以非常适合在狗使用为谁商业化生产的，经过验证的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA