Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Resumen

trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.

Resumen

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Introducción

Hay más de 70 millones de perros en los EE.UU. solamente ^1. Como miembros de la familia valorados, estos animales a menudo reciben la atención médica de corte borde. Del mismo modo, ya que comparten nuestro medio ambiente, los perros pueden ayudar a comprender la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades humanas ^1. Sin embargo, si la traducción de los descubrimientos en la medicina humana en tratamientos veterinarios o viceversa, es importante para caracterizar completamente las variaciones de especies incluso en sistemas altamente conservadas tales como la respuesta inmune innata. Ejemplos de diferencias entre el canino y el sistema inmune innato humano incluyen una alta expresión de CD4 en perros neutrófilos ^2; la ausencia de un homólogo funcional del sensor flagelina citoplásmica IPAF en perros ³ y la expresión de un híbrido de la caspasa 1/4 en los carnívoros ^4.

Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son un componente relativamente reciente descubrimiento de la inmunidad innata ^5. Las redes son la reds de ADN, las proteínas nucleares y granulares libera en respuesta a una amplia gama de estímulos inflamatorios o infecciosos ^6. Estructuras en forma de red se han demostrado en muchas especies incluyendo pollos ^7, peces, moluscos ^{8 9} y ¹⁰ acoelomates, pero hay variaciones de especies. Por ejemplo, los neutrófilos murinos responden más lentamente a los estímulos NETosis que los neutrófilos humanos, y forman TNE menos difusas ^11. Hay una gran cantidad de evidencia de múltiples especies que las redes atrapan los microbios, y más polémica puede estar directamente involucrados en la eliminación de patógenos ^12,13. Sin embargo, los componentes de red también aumentan el daño tisular, promueven la trombosis y actúan como autoantígenos ^14,15. El equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de redes pueden variar entre diferentes enfermedades y las diferentes especies, lo que sugiere que es importante investigar TNE tanto en la especie y condición de interés.

Aquí nosotrosdescribir un protocolo sencillo para inducir y medir la liberación de los TNE por los neutrófilos caninos. Este método es similar a los utilizados para aislar los neutrófilos ¹⁶ e inducir NETosis en otras especies, pero las condiciones tales como la concentración de agonista y tiempo de incubación han sido optimizados para los neutrófilos caninos. Un ensayo de liberación de ADN cuantificación NET similares también se ha descrito en otras especies, pero el método que aquí se presenta también está optimizado para perros ^8,17,18.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo con el permiso del Comité de ética de la Universidad Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Iowa.

1. Recolección de Sangre

1. Dibuje 9 ml de sangre de un safena, la vena cefálica o yugular directamente en anticoagulante (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1,8 mg K ₂ EDTA / ml de sangre) vacutainers, o en una jeringa con transferencia inmediata a tubos de sangre que contenían EDTA. rodar suavemente o invertir los tubos de sangre para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y anti-coagulante.

2. Aislamiento de neutrófilos

1. En un tubo cónico de 50 ml, mezclar la sangre con un volumen igual de la temperatura ambiente estéril 3% de dextrano-500 (hecho en 0,9% de solución salina estéril) por inversión suave. Dejar reposar en posición vertical durante 18-20 minutos a temperatura ambiente. La transferencia de la capa superior de color paja a un tubo fresco hasta que ya no puede ser recogido sin contaminación por la capa roja inferior. Los eritrocitos en THtubo original, e puede ser desechada.
2. Centrifugar el sobrenadante a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar y descartar el sobrenadante. Manualmente volver a suspender el sedimento celular en 10 ml de solución salina tamponada temperatura ambiente estéril de fosfato (PBS). Tenga en cuenta que vórtex no se debe utilizar para volver a suspender los neutrófilos en cualquier etapa de este protocolo. dibujo manualmente, en lugar de verter fuera sobrenadantes también se recomienda durante todo el protocolo para maximizar el rendimiento celular.
3. Añadir 10 ml de una solución de separación de células polisucrosa temperatura ambiente y diatrizoato de sodio (por ejemplo, Histopaque 1077) a un tubo cónico de 50 ml. capa cuidadosamente la solución que contiene células sobre la solución de separación de células. Tenga en cuenta que la solución de separación celular mediante el cual no se haya equilibrado a temperatura ambiente pueden reducir el rendimiento de la célula.
4. Centrifugar a 300 xg durante 30 min a temperatura ambiente con el freno.
5. A medida que los neutrófilos se encuentran en la capa más baja de la pendiente, extraer y desechar la upper 3 capas, compuestas de una capa superior de plasma y plaquetas, una banda blanca estrecha de células mononucleares y una capa clara del medio de gradiente de densidad.
6. Para lisar los eritrocitos ningún restantes, vuelva a suspender el sedimento de neutrófilos en 10 ml de agua a temperatura ambiente.
7. Después de 30 segundos, restaurar la tonicidad mediante la adición de 10 ml de cloruro de sodio 1,8% estéril temperatura ambiente y mezclar suavemente por inversión.
8. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Trasvasar el sobrenadante y desechar.
9. Si la pastilla es todavía roja, repetir la etapa de lisis. Si la pastilla es de color blanco (o si la lisis ya se ha realizado dos veces), suavemente las células volver a suspender en 10 ml de PBS estéril.
10. Recuento de células utilizando un contador automatizado o un hemocitómetro. Los rendimientos típicos son al menos 10 ⁶ células por ml de sangre.
11. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Trasvasar el sobrenadante y desechar.
12. células a la concentración deseada en la temperatura ambiente PBS estéril resuspender. for el ensayo de liberación de ADN descrita en la sección 2, se vuelve a suspender en 5 x 10 ⁶ células por ml.
13. Si se desea, la transferencia de un pequeño volumen de células directamente o usando una citocentrífuga a un portaobjetos de vidrio. Permiten que las células se sequen y las manchas utilizando un kit de fijación y la tinción rápida de acuerdo con la fabrica 'instrucciones. Si el aislamiento de neutrófilos ha sido exitosa, cuando se examinan bajo el microscopio al menos 95% de las células nucleadas debe ser granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) con mínima contaminación de eritrocitos.

3. Ensayo de liberación de ADN

1. Configurar el ensayo de liberación de ADN inmediatamente después del aislamiento de neutrófilos.
2. Si la aglutinación de células está presente en el examen de la solución madre por microscopía de luz, pasar la suspensión celular a través de un filtro estéril de 70 micras estéril inmediatamente antes de establecer el ensayo.
3. A cada pocillo de ensayo de una placa estéril 96, añadir 5 x 10 ⁴ células / pocillo; agonista y Memo Roswell Parkrial Institute-1640 (RPMI) medio sin rojo fenol y suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 0,5% para un volumen final de 100 a 200 l. Incluir al menos dos pocillos de blanco por agonista en la que la solución de neutrófilos de stock se sustituye por un volumen igual de PBS. Tenga en cuenta que la creación de pozos en blanco para cada agonista es importante para descartar la contaminación del ADN del agonista o interferencia por parte del agonista con el ensayo de fluorescencia.
4. Incubar a 39 ° C durante 30 min en un incubador de dióxido de carbono (4%).
5. Añadir agonistas a concentraciones deseadas y un colorante de ácido nucleico impermeable a las células. Tenga en cuenta la concentración óptima de colorante impermeable a las células variará entre diferentes tintes de ácidos nucleicos. controles no estimuladas con agonistas en el que se sustituyen por un volumen igual de medios de comunicación deben ser incluidos en cada experimento.
   NOTA: Es deseable diluir agonistas en volúmenes similares de medio de cultivo para mantener condiciones consistentes entre los pozos. así volúmenes finales de 200 y# 181; l se han utilizado con éxito y si esto se altera, así volúmenes debe permanecer idéntica para todas las condiciones. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentración final ≥0.1 M) o factor activador de plaquetas (PAF) (concentración final ≥31 M) se puede utilizar como controles positivos. Agonistas deben medirse al menos por duplicado.
6. Se incuba a 39 ° C. Medir la fluorescencia usando un lector de microplacas después de 2 horas o a intervalos deseados. Tenga en cuenta que los intervalos de tiempo óptimos variarán con agonistas utilizados.
   NOTA: Longitud de onda dependerá de colorante empleada.
7. Restar la fluorescencia en blanco antes de calcular la fluorescencia media.
8. Para permitir la comparación entre los individuos y entre las placas, calcular un factor de cambio en la fluorescencia dividiendo la fluorescencia media de los pocillos estimulados por la fluorescencia media de los pocillos no estimulados.

Resultados

Usando este protocolo, debería haber un cambio veces fuerte en la fluorescencia después de la estimulación de los neutrófilos con los controles positivos, PMA y PAF. Como se ilustra en la Figura 1B, la estimulación de los neutrófilos caninos con 31 mM de PAF para 1 hr resultados en un aumento de 4,0 veces en la fluorescencia media en comparación con las células no estimuladas (rango 2,0 a 5,8, n = 5 perros) ^18. PMA a 0.1 M (Figura 1A) ...

Discusión

El ensayo de liberación de ADN presentada es un ensayo fácilmente cuantificables para el ADN extracelular. El método fue adaptado de técnicas similares que se utilizan para evaluar la formación neta de otras especies, pero la velocidad de centrifugación, las concentraciones de agonistas y los tiempos de incubación han sido alterados para optimizar el método para su uso con los neutrófilos caninos ^8,17,18. ajustes similares podrían hacerse para adaptar el método para otras especies. El ensayo es sen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA