Простой флуоресценция Анализ на Количественное Собачий Нейтрофильная внеклеточной Trap Release

Резюме

Нейтрофильных внеклеточные ловушки (НРТ) представляют собой сети ДНК, гистонов и нейтрофильных белков. Хотя компонент врожденного иммунного ответа, Сетки замешан в аутоиммунной реакции и тромбоза. Этот протокол описывает простой метод собачьего выделения нейтрофилов и количественного НЭО с использованием анализа микропланшет флуоресценции.

Аннотация

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Введение

Есть более 70 миллионов домашних собак только в США ^1. Как уважаемых членов семьи, эти животные часто получают ультрасовременную медицинскую помощь. В равной степени , потому что они разделяют нашу окружающую среду, собаки могут дать представление о патогенезе и лечении заболеваний человека ^1. Тем не менее, является ли перевод открытий в медицине человека в ветеринарным обработкам, или наоборот, важно тщательно охарактеризовать его видовые разновидности, даже в высоко консервативны системах, таких, как врожденной иммунной реакции. Примеры различий между клыка и врожденной иммунной системы человека , включают в себя высокий уровень экспрессии CD4 на собачьих нейтрофилы ^2; отсутствие функционального гомолога цитоплазматической датчика флагеллином IPAF у собак ³ и экспрессия каспазы 1/4 гибрид в плотоядным ^4.

Нейтрофильных внеклеточные ловушки (НРТ) являются сравнительно недавно обнаруженный компонент врожденного иммунитета ^5. Сетки сетьс ДНК, ядерные и гранулированных белки , высвобождаемые в ответ на широкий круг воспалительного или инфекционного раздражители ^6. NET-подобные структуры были продемонстрированы во многих видов , включая кур ^{7, 8} рыб, моллюсков ⁹ и acoelomates ^10, но существуют различия видов. Например, мышиные нейтрофилы реагируют более медленно , чем NETosis раздражители нейтрофилов человека, и образуют диффузные менее ¹¹ сетей не . Существует большое количество доказательств из нескольких видов , которые НРТ взбитых микробов, и более спорно , могут быть непосредственно вовлечены в убийство патогены ^12,13. Тем не менее, NET компоненты также увеличивают повреждения тканей, способствуют тромбообразованию и выступать в качестве аутоантигенов ^14,15. Баланс между желательными и пагубные последствия сеток может варьироваться от различных заболеваний и различных видов, предполагая, что важно исследовать как в сетей не от вида и состояния интереса.

Мы тутописывают простой протокол для индукции и измерения высвобождения НЭО на собачьих нейтрофилов. Этот метод аналогичен тем , которые используются для изоляции нейтрофилы ¹⁶ и индуцируют NETosis у других видов, но условия , такие как повышенная концентрация агониста и времени инкубации были оптимизированы для собачьих нейтрофилах. Похожая NET анализа высвобождения Количественное ДНК также была описана у других видов , но метод , представленный здесь также оптимизирован для собак ^8,17,18.

протокол

Все эксперименты проводились с этической разрешения Iowa Государственного комитета университета Институциональная уходу и использованию животных.

Коллекция 1. Кровь

1. Draw 9 мл крови из подкожных, головными или яремную вену непосредственно в антикоагулянта (например, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1,8 мг K ₂ ЭДТА / мл крови) vacutainers, или в шприц с немедленным переходом на ЭДТА пробирки , содержащие крови. Осторожно катить или инвертировать трубки крови, чтобы обеспечить адекватное перемешивание крови и антикоагулянта.

2. Нейтрофильная Изоляция

1. В коническую пробирку емкостью 50 мл, перемешать кровь с равным объемом стерильного комнатной температуры 3% декстрана-500 (составил в 0,9% стерильного солевого раствора) путем осторожного переворачивания. Оставьте стоять в вертикальном положении в течение 18-20 мин при комнатной температуре. Перенести соломенного цвета верхний слой в свежую пробирку, пока он больше не может быть собрана без загрязнения нижнего красного слоя. Эритроциты в тысе оригинальная трубка может быть отброшен.
2. Центрифуга супернатант при 500g в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Откачать и отбросить супернатант. Вручную повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл при комнатной температуре стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS). Обратите внимание, что вортексе не следует использовать для ресуспендируйте нейтрофилы на любой стадии этого протокола. Вручную оттягивая, а не заливкой от супернатантов также рекомендуется по всему протоколу для максимального выхода клеток.
3. Добавляют 10 мл раствора дл разделени клеток при комнатной температуре polysucrose и диатризоат натрия (например, Histopaque 1077) в 50 мл коническую пробирку. Тщательно слой клеточной раствора, содержащего над раствором дл разделени клеток. Обратите внимание, что использование раствора разделения клеток, которые не доведены до комнатной температуры может привести к снижению выхода клеток.
4. Центрифуга при 300 х г в течение 30 мин при комнатной температуре с тормозным выключенном.
5. Поскольку нейтрофилы находятся в самом нижнем слое градиента, оттянуть и отбросить uppeR 3 слоя, состоящие из верхнего слоя плазмы и тромбоцитов, узкой белой полосой мононуклеарных клеток и прозрачный слой градиента плотности среды.
6. Для лизиса оставшихся эритроцитов, повторно приостановить нейтрофилов осадок в 10 мл воды комнатной температуры.
7. После того, как 30 секунд, восстановление тоничность путем добавления 10 мл стерильной при комнатной температуре 1,8% натрия хлорида и перемешать аккуратным переворачиванием.
8. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Откачать супернатант и выбросьте.
9. Если осадок все еще красный, повторите шаг лизиса. Если осадок белого цвета (или если лизис уже выполнена дважды), осторожно повторно приостанавливать клеток в 10 мл стерильной PBS.
10. Граф клеток с использованием автоматизированного счетчика или гемоцитометра. Типичные выходы по меньшей мере , 10 ⁶ клеток на мл крови.
11. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Откачать супернатант и выбросьте.
12. Повторное приостановить клетки до требуемой концентрации в стерильном PBS при комнатной температуре. Foг анализ высвобождения ДНК описано в разделе 2, ресуспендируют в 5 × 10 ⁶ клеток на мл.
13. При желании передать небольшой объем клеток непосредственно или с помощью цитоцентрифуге на предметное стекло. Разрешить клетки и высушить пятно с помощью быстрой фиксации и окрашивания комплект в соответствии с инструкциями изготовителей ". Если изоляция нейтрофильный была успешной, при ближайшем рассмотрении под микроскопом по крайней мере, 95% ядерных клеток должны быть гранулоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы) с минимальным загрязнением эритроцита.

3. Анализ ДНК-релиз

1. Настройка анализа высвобождения ДНК сразу после выделения нейтрофилов.
2. Если клетка слипания присутствует на рассмотрении исходного раствора с помощью световой микроскопии, проходят клеточной суспензии через стерильный 70 мкм стерильный фильтр непосредственно перед установкой анализа.
3. Для каждой тестируемой лунки стерильного 96 - луночного планшета, добавляют 5 х 10 ⁴ клеток / лунку; агонист и Roswell Park Memoриал институт-1640 (RPMI) среде без фенола красного и дополненной 0,5% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка до конечного объема 100-200 мкл. Включите по крайней мере две пустые лунки за агонистом, в котором нейтрофилы маточный раствор заменено равным объемом PBS. Обратите внимание, что создание пустых лунок для каждого агониста имеет важное значение в исключает загрязнение ДНК агониста или вмешательства со стороны агониста с флуоресцентного анализа.
4. Инкубируют при 39 ° С в течение 30 мин в диоксид углерода (4%) инкубаторе.
5. Добавить агонисты в желаемых концентрациях и клетки непроницаема красителя нуклеиновых кислот. Обратите внимание на оптимальную концентрацию клеток непроницаемой краситель будет варьироваться между различными красителями нуклеиновых кислот. Нестимулированных средства управления, в которых агонисты заменены равным объемом средств массовой информации должны быть включены в каждом эксперименте.
   Примечание: Желательно, чтобы разбавить агонистами в аналогичных объемах культуральной среды для поддержания постоянных условий между скважинами. Окончательные объемы лунка 200 &# 181; л, были успешно использованы, и если это будет изменено, а объемы должны оставаться одинаковыми для всех условий. Форболовыми-12-миристат-13-ацетата (РМА) (конечная концентрация ≥0.1 мкМ) или фактор активации тромбоцитов (ФАТ) (конечная концентрация ≥31 мкМ) может быть использован в качестве положительного контроля. Агонисты должны измеряться по меньшей мере, в двух экземплярах.
6. Инкубируют при 39 ° С. Измерение флюоресценции с использованием микропланшет-ридера через 2 часа или в требуемых интервалах. Следует отметить, что оптимальные интервалы времени будут меняться в зависимости от используемых агонистов.
   Примечание: Длина волны будет зависеть от красителя, используемого.
7. Вычтите пустой флуоресценции до расчета средней флуоресценции.
8. Для того, чтобы провести сравнение между отдельными людьми, так и между пластинами, вычислить кратное изменение флуоресценции путем деления средней флуоресценции стимулированных скважин средней флуоресценции нестимулированных скважин.

Результаты

При использовании этого протокола, должно быть сильное изменение раза в флуоресценции после того, как стимулирующее нейтрофилы с положительным контролем, РМА и PAF. Как показано на рисунке 1В, стимуляция собачьих нейтрофилов с 31 мкМ СУП для 1 результатов ч в сре...

Обсуждение

Анализ ДНК-релиз представлен представляет собой легко поддаются количественной оценке для анализа внеклеточной ДНК. Этот метод был адаптирован из подобных методов , используемых для оценки NET формирование у других видов, но скорость центрифугирования агонист концентрации и времени и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA