Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Özet

Nötrofil dışı tuzaklar (NET) DNA, histon ve nötrofil proteinlerin ağlardır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir bileşeni olmasına rağmen, ağ otoimmün ve tromboz implike edilmiştir. Bu protokol, köpek nötrofil izolasyon ve bir mikroplaka flüoresans deneyi kullanılarak NET'ler ölçümü için basit bir yöntem tarif eder.

Özet

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Giriş

70 milyon evcil köpekler ¹ yalnız ABD'de bulunmaktadır. Değerli aile üyeleri olarak, bu hayvanlar genellikle kenar tıbbi bakım kesim alırsınız. Onlar bizim ortamı paylaşmak Eşit, çünkü köpekler insan hastalıkları ¹ patogenezinde ve tedavisinde içgörü sağlayabilir. Ancak, veterinerlik uygulamaları ya da tam tersi olarak insan tıbbında keşifler çeviri olup, iyice gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bile yüksek ölçüde korunmuş sistemlerde türleri varyasyonları karakterize etmek için önemlidir. Köpek ve insan doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki farklar örnekleri köpek nötrofil ² yüksek ifade CD4 arasında; Köpeklerde ³ sitoplazmik flagellin sensörü IPAF fonksiyonel homolog olmaması ve etobur ⁴ bir kaspaz 1/4 melez ifadesi.

Nötrofil dışı tuzaklar (NET) doğuştan gelen bağışıklık ⁵ nispeten yeni keşfedilen bileşenidir. NET'ler ağı vardırenflamatuar veya enfeksiyöz uyaranlara ⁶ geniş bir tepki olarak serbest DNA çekirdek ve granül proteinleri s. NET benzeri yapılar tavuk ^7, balık ^8, yumuşakçalar ⁹ ve ¹⁰ acoelomates dahil olmak üzere birçok türler arasında gösterilmiştir, ancak tür farklılıklar vardır. Örneğin, kemirgen nötrofiller, insan nötrofillerinden daha NETosis uyaranlara yanıt daha yavaş ve daha az yaygın NET'leri ¹¹ oluşturur. NET'ler doğrudan patojenleri ^12,13 öldürme dahil olabilir daha tartışmalı mikropları yakalamak ve çoklu türlerden kanıt büyük bir gövde var. Ancak, NET bileşenleri de, doku hasarına geliştirmek ^14,15 Otoantijenler olarak trombozu ve hareket teşvik. NET'ler yararlı ve zararlı etkilerini arasındaki denge tür ve ilgi durumda her iki NET'leri araştırılması önemlidir öne farklı hastalıklar ve farklı türler arasında değişebilir.

buradauyaran ve köpek nötrofiller tarafından NET'ler salınımını ölçmek için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, nötrofil ¹⁶ izole etmek ve diğer türlerde NETosis uyarılması için kullanılanlara benzer, ancak bu tür agonist konsantrasyonunun ve kuluçkalama süresi gibi koşullar, Kanin nötrofiller için optimize edilmiştir. Benzer bir .NET miktar DNA salma tahlili diğer türlerde de tarif edilmiştir, ancak burada sunulan yöntem köpeklerde ^8,17,18 için optimize edilmiştir.

Protokol

Tüm deneyler Iowa State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu etik izni ile yapıldı.

1. Kan Toplama

1. Şirketinden antikoagülan bir safen, baş ya da boyun damarından kan 9 ml çizin (örneğin, etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1.8 mg K ₂ EDTA / ml kan) vacutainers veya EDTA içeren kan tüplerine anında transfer bir şırınga içine. Yavaşça rulo veya kan ve anti-koagülan yeterince karışmasını sağlamak için, kan tüpler ters.

2. Nötrofil İzolasyon

1. 50 ml'lik konik bir tüp içinde, steril, oda sıcaklığında eşit hacimde kan karışımı% 3 özenli bir şekilde ters tarafından dekstran-500 (% 0.9 steril tuzlu su içinde oluşan). Oda sıcaklığında 18-20 dakika süreyle dik ayakta bırakın. artık düşük kırmızı katmanı tarafından kontaminasyon olmadan toplanabilir kadar yeni bir tüp saman renkli üst katman aktarın. th eritrositlerE orijinal tüp atılabilir.
2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 500 xg'de süpernatant santrifüjleyin. kapalı çizin ve supernatant atın. El ile 10 mi oda sıcaklığında steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücre pelletini yeniden askıya. bu vorteksleme Bu protokolün her aşamasında yeniden askıya nötrofiller için kullanılmamalıdır edin. El ile yerine aynı zamanda hücre verimi en üst düzeye çıkarmak için protokol boyunca tavsiye edilir süpernatantlar dökülen daha kapalı çizim.
3. 50 ml konik tüp, oda sıcaklığındaki bir polisükroz ve sodyum Diatrizoate hücre ayırma çözeltisi (ör Histopaque 1077) 10 ml ilave edilir. Dikkatle hücre ayırma çözümü üzerinde hücre içeren çözüm katmanı. Hücre sayısını azaltabilir, oda sıcaklığına gelmesi olmadığını kullanılarak hücre ayırma çözeltisi edin.
4. Fren kapalı olarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
5. Nötrofiller degrade en alt tabakada olduğu gibi, kapalı çizmek ve uppe atmakplazma ve trombositler, tek çekirdekli bir hücre beyaz dar bant ve yoğunluk gradyan ortamının açık bir tabakanın bir üst tabaka oluşur R3 tabakalar.
6. Kalan, eritrositleri lizise uğratmak için, oda sıcaklığında 10 ml su nötrofil pelet yeniden askıya.
7. 30 saniye sonra, steril oda sıcaklığında% 1.8 sodyum klorür, 10 ml ekleyerek tonikliğinin geri ve yumuşak ters çevirerek karıştırın.
8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. süpernatant çizin ve atın.
9. pelet hala kırmızı ise, parçalama adımı tekrarlayın. Pelet beyaz (veya lizis zaten iki kez gerçekleştirilmiştir halinde), yavaşça steril PBS, 10 ml hücrelerin yeniden askıya edin.
10. otomatik bir sayaç veya hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Tipik verim kan ml'si başına en az 10 ⁶ hücre vardır.
11. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. süpernatant çizin ve atın.
12. steril oda sıcaklığı PBS içinde istenen konsantrasyona hücrelerin yeniden askıya. for DNA salınım testi ml başına 5 x 10 ⁶ hücre, 2. bölümde tekrar süspansiyon nitelendirdi.
13. Arzu edildiği takdirde, hücrelerin küçük bir hacmi ile doğrudan transferi veya cam slayt, bir sitosantrifüj kullanılmıştır. Hücreler kuru ve leke ", üretici talimatlarına göre hızlı bir sabitleme ve boyama kiti kullanılarak izin verin. mikroskop altında incelendiğinde, nötrofil izolasyonu, başarılı ise çekirdekli hücrelerin en az% 95 oranında en az eritrosit bulaşma ile granülositler (nötrofiller, bazofiller, eozinofiller) olmalıdır.

3. DNA Salım Deneyi

1. nötrofil izolasyon hemen sonra, DNA salım deneyi ayarlayın.
2. Hücre topaklanma ışık mikroskobu ile stok solüsyon muayenesinde varsa, hemen tahlil kurmadan önce steril 70 mikron steril filtre ile hücre süspansiyonu geçmektedir.
3. Steril 96 oyuklu plakanın her bir test kuyucuğuna, 5 x 10 ⁴ hücre / çukur ekleyin; Agonist ve Roswell Park Notfenol kırmızı ve 100-200 ul son hacim olması için% 0.5 ısıyla inaktive edilmiş cenin dana serumu ile takviye edilmiş olmayan arteryel Enstitüsü 1640 (RPMI) ortamında. nötrofil stok çözeltisi PBS eşit hacimde ile ikame edildiği agonist en az iki Boş kaplar içerir. Her agonist için boş kuyu kurma floresan deneyi ile agonist tarafından agonisti veya parazit DNA kontaminasyonu dışlanması önemli olduğunu unutmayın.
4. bir karbon dioksit (% 4) kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca 39 ° C'de inkübe edin.
5. istenen konsantrasyonlar ve hücre geçirmeyen bir nükleik asit boyası agonistler ekleyin. farklı nükleik asit boyaları arasında değişecektir hücre geçirmeyen boyanın optimal konsantrasyonunu edin. agonistleri ortamın eşit hacimde ile ikame edildiği, uyarılmamış kontrol her deneyde dahil edilmelidir.
   NOT: Bu kuyu arasında tutarlı koşulları sağlamak için kültür ortamı içindeki hacim agonistleri seyreltilmesi tercih edilir. 200 nihai oyuk hacimleri &# 181; l başarıyla kullanılmaktadır ve bu değişmiş ise, iyi hacimleri tüm koşullar için aynı kalmalıdır. Forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) (nihai konsantrasyon ≥0.1 uM) ya da platelet aktive edici faktör (PAF) (nihai konsantrasyon ≥31 uM) ve pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Agonistler iki kez, en azından ölçülmelidir.
6. 39 ° C'de inkübe edin. 2 saat sonra veya arzu edilen aralıklarda bir mikroplaka okuyucusu kullanılarak floresan ölçülür. Optimum zaman aralığı kullanılan agonistler ile değişecektir unutmayın.
   NOT: Dalga boyu istihdam boya bağlıdır.
7. ortalama floresan hesaplamadan önce boş floresan çıkarın.
8. bireyler arasında ve plakalar arasında karşılaştırma sağlamak için, uyarılmamış kuyuların ortalama fluoresans ile uyarılmış kuyuların ortalama floresan bölünmesiyle floresansta bir katlama değişimi hesaplamak.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, pozitif kontroller, PMA ve PAF ile nötrofilleri stimüle sonra floresan kuvvetli bir kat değişiklik olması gerekir. Uyarılmamış hücrelere (dağılım 2,0-5,8, s = 5 köpek) ¹⁸ ile karşılaştırıldığında floresanstaki ortalama 4.0 kat bir artış ile 1 saat sonuçlar için 31 uM PAF Şekil 1B, köpek nötrofillerin uyarılması gösterildiği gibi. 0.1 uM (Şekil 1A) PMA 2 saat kadar floresansta bir art?...

Tartışmalar

sunulan DNA salınım testi dışı DNA için bir kolaylıkla ölçülebilir testtir. Yöntem, diğer türlerdeki NET oluşumunu değerlendirmek için kullanılan benzer teknikler uyarlanmıştır ancak santrifüj hızları agonist konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri köpek nötrofil ^8,17,18 ile kullanım için bir yöntem optimize etmek için değiştirildi. Benzer düzenlemeler, diğer türler için bir yöntem adapte yapılabilir. deney gibi akış sitometrisi veya görüntü analizi gibi NETosis ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA