イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

要約

好中球細胞外トラップ（ネット）DNA、ヒストンおよび好中球のタンパク質のネットワークです。先天性免疫応答の成分が、ネットは自己免疫および血栓症に関与しています。このプロトコルは、イヌ好中球の単離およびマイクロプレート蛍光アッセイを用いてのNETの定量化のための単純な方法を記載しています。

要約

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

概要

米国だけ¹万人の70以上のペットの犬があります。大切な家族のように、これらの動物は、多くの場合、エッジ医療を切断受けます。彼らは私たちの環境を等しく共有しているため、犬は人間の病気¹の病因と治療への洞察を提供することができます。しかし、獣医学的治療またはその逆に人間の医学の発見を翻訳するかどうか、徹底的にあっても、そのような先天性免疫応答のような高度に保存されたシステムでは、種のバリエーションを特徴づけることが重要です。イヌとヒトの先天性免疫系の間の違いの例としては、犬の好中球²に高発現CD4を含みます。犬³と肉食⁴におけるカスパーゼ1/4ハイブリッドの発現の細胞質フラジェリンセンサーIPAFの機能的ホモログが存在しません。

好中球細胞外トラップ（ネット）、先天性免疫⁵の比較的最近発見されたコンポーネントです。ネットネットワークであります炎症性または感染性の刺激⁶の広い範囲に対応して放出されたDNA、核および粒状タンパク質の秒。 NETのような構造は、ニワトリ^7、魚^8、軟体動物⁹および^10を acoelomates含む多くの種を越えて実証されているが、種のバリエーションがあります。例えば、マウス好中球は、ヒト好中球よりNETosisの刺激に応答速度が遅く、少ない拡散のNET ^11を形成^します 。ネットは直接病原体^12,13を殺害に関与している可能性がより多くの論争の微生物を捕捉し、複数の種からの多くの証拠があります。しかし、NETコンポーネントはまた、組織の損傷を高める^14,15を自己抗原として血栓症や行動を推進しています。 NETの有益と有害な影響のバランスは、種と関心の状態の両方でネットを調査することが重要である示唆し、異なる疾患と異なる種の間で異なる場合があります。

ここでイヌの好中球によるのNETの放出を誘導し、測定するための単純なプロトコルを記述します。この方法は、好中球^16を分離し、他の種にNETosisを誘導するために使用されるものと同様であるが、そのようなアゴニスト濃度およびインキュベーション時間などの条件は、イヌ好中球のために最適化されています。同様のNET定量DNA放出アッセイは、他の種に記載されているが、ここで提示された方法はまた、イヌ^8,17,18のために最適化されています。

プロトコル

すべての実験は、アイオワ州立大学の施設内動物管理使用委員会から倫理的な許可を得て行われました。

1.採血

1. バキュテイナー抗凝固剤に直接橈側または頸静脈、伏在から血液の9ミリリットルを描く（ 例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1.8ミリグラムのK ₂ EDTA / mlの血液）、またはEDTAを含有する血液管への即時転送にシリンジに。穏やかにロールまたは血液と抗凝固剤の適切な混合を確実にするために、血液チューブを反転させます。

2.好中球の分離

1. 50ミリリットルコニカルチューブでは、無菌の室温等容積の血液を混ぜて3パーセント穏やかに反転することにより、デキストラン-500（0.9％滅菌生理食塩水で作製）。室温で18〜20分間、直立したままにしておきます。それはもはや下位赤色層による汚染なしに収集されなくなるまで新鮮なチューブに淡黄色の上層を転送します。目中の赤血球E元のチューブを廃棄することができます。
2. 4℃で10分間、500×gで上清を遠心。オフ描画し、上清を捨てます。 10mLの室温の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に手動で再懸濁細胞ペレット。そのボルテックスは、このプロトコルのいずれかの段階で再懸濁好中に使用すべきではありません注意してください。手動でオフに描くのではなく、上清を捨てることも、細胞収率を最大化するためのプロトコル全体で推奨されています。
3. 50ミリリットルコニカルチューブに室温ポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウム細胞分離液（ 例えば 、ヒスト1077）の10ミリリットルを追加します。慎重に細胞分離溶液上に細胞含有液を層。室温に平衡化されていない細胞分離液を使用して、細胞収率を低下させることができることに留意されたいです。
4. ブレーキをオフにして、室温で30分間、300×gで遠心分離します。
5. 好中球は勾配の最下層にあるように、オフ描き、uppeを捨てます血漿および血小板、単核細胞の狭ホワイトバンドと密度勾配媒体の透明層の上層からなるR 3層。
6. 残りの赤血球を溶解するために、室温の水10ml中の好中球ペレットを再懸濁します。
7. 30秒後、滅菌室温1.8％の塩化ナトリウムの10ミリリットルを追加することで、張性を回復し、穏やかに転倒混和します。
8. 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。上清をオフに描画し、廃棄します。
9. ペレットがまだ赤の場合、溶解工程を繰り返します。ペレットは白色である（または溶解が既に2回行っている場合）、穏やかに無菌PBS 10ml中に細胞を再懸濁した場合。
10. 自動化されたカウンターまたは血球計数器を用いて細胞を数えます。典型的な収量は、血液1mlあたり少なくとも10 ⁶細胞です。
11. 4℃で5分間、500×gで遠心分離します。上清をオフに描画し、廃棄します。
12. 無菌の室温PBSで所望の濃度に細胞を再懸濁。フォー1mlあたり5×10 ⁶細胞で再懸濁、セクション2に記載のDNA放出アッセイrを。
13. 必要であれば、細胞の小容積を直接転送したり、スライドガラスに細胞遠心を使用。細胞は「製造業者の指示に従って迅速な固定および染色キットを用いて乾燥し、染色することができます。好中球の単離に成功した場合、有核細胞の顕微鏡で調べ、少なくとも95％は、最小限の赤血球の混入と顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）でなければなりません。

3. DNA放出アッセイ

1. 好中球の単離後、直ちにDNA放出アッセイを設定します。
2. 細胞凝集は、光顕微鏡によるストック溶液の審査に存在する場合、すぐにアッセイを設定する前に、無菌の70μmの滅菌フィルターを通して細胞懸濁液を渡します。
3. 滅菌96ウェルプレートの各試験ウェルに、5×10 ⁴細胞/ウェルを追加。アゴニストおよびロズウェルパークメモ赤及び100~200μlの最終体積0.5％の熱不活化ウシ胎仔血清を補充したフェノールなしリアル研究所-1640（RPMI）培地。好中球のストック溶液を、等量のPBSで置換したアゴニスト当たり少なくとも二つのブランクウェルを含みます。各アゴニストのためのブランクウェルを設定すると、蛍光アッセイでアゴニストによるアゴニストまたは干渉のDNAの混入を排除する上で重要であることに注意してください。
4. 二酸化炭素（4％）インキュベーター内で30分間39℃でインキュベートします。
5. 所望の濃度および細胞不透過性核酸色素でアゴニストを追加します。細胞不透過性色素の最適濃度が異なる核酸色素の間で異なることに注意してください。アゴニストは培地の等量で置換された非刺激対照を各実験に含まれるべきです。
   注：これは、ウェル間の一貫性の条件を維持するために、培地の同様の量のアゴニストを希釈することが望ましいです。 200の最終的なウェルボリューム＆＃181; lは正常に使用されており、これが変更されている場合、十分ボリュームはすべての条件のために同一のままであるべきです。ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）（最終濃度≥0.1μM）または血小板活性化因子（PAF）（最終濃度≥31μM）を陽性対照として使用することができます。アゴニストは重複し、少なくとも測定されるべきです。
6. 39℃でインキュベートします。 2時間後に、または所望の間隔でマイクロプレートリーダーを用いて蛍光を測定します。最適な時間間隔が使用アゴニストとともに変化することに注意してください。
   注：波長が用いられる色素に依存します。
7. 平均蛍光を計算する前に、ブランクの蛍光を引きます。
8. 個人間およびプレート間の比較を可能にするために、非刺激ウェルの平均蛍光によって刺激されたウェルの平均蛍光を分割することにより、蛍光の変化倍率を計算します。

結果

このプロトコルを使用して、ポジティブコントロール、PMAおよびPAFで好中球を刺激した後、蛍光の強い倍数変化があるはずです。非刺激細胞（範囲2.0から5.8、N = 5匹の犬^）18と比べて蛍光が平均4.0倍の増加で1時間の結果を得るために31μMPAFと図1B、イヌ好中球の刺激に示すように。 ^{18：0.1μM（} 図1A）でPMAは2時間までの蛍光の増?...

ディスカッション

提示されたDNA放出アッセイは、細胞外DNAのために容易に定量化できるアッセイです。この方法は、同様の他の種でNET形成を評価するために使用される技術が、遠心分離速度、アゴニスト濃度から適応され、インキュベーション時間は、イヌ好中球^8,17,18で使用するための方法を最適化するために変更されています。同様の調整は、他の種のための方法を適合させることができます。こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA