基于植物的提取胶囊微胶囊化应用

摘要

这个协议/手稿描述了生产由伸筋草芽孢孢粉外壁胶囊（秒）的和为亲水性化合物为这些肝窦的装载一个简化的流程。

摘要

从植物为基础的孢子或衍生的微胶囊提供一个多元化的微胶囊化应用提供了强大的平台。当孢子或花粉进行处理，以除去内部sporoplasmic内容孢粉外壁胶囊（秒）获得。得到的中空微胶囊表现出高度的粉体学均匀性并保留相关的特定植物物种错综复杂显微结构特征。在此，我们展示了从伸筋草孢子生产SEC的和为亲水性化合物进入这些SEC的加载一个简化的流程。当前SEC分离过程最近已经优化以显著减少其常规SEC中单独使用的处理的要求，并确保生产完整微囊。自然L. clavatum孢子脱脂用丙酮，用磷酸处理过的，并充分洗涤以除去sporoplasmiC含量。丙酮脱脂后，用85％的磷酸一单个处理步骤已被证明以除去所有sporoplasmic内容。通过限制酸处理时间为30小时，这是可以分离干净肝窦和避免SEC压裂，这已被证明与延长处理时间发生。用清水充分冲洗，稀酸，稀碱和溶剂确保所有sporoplasmic物质和化学残留物被充分去除。真空加载技术被利用来加载一个模型蛋白（牛血清白蛋白），为代表的亲水性化合物。真空装载提供了一种简单的技术来装载的各种化合物，而不需要这往往需要在其他微囊协议苛刻的溶剂或不希望的化学品。根据这些隔离和装载协议，SEC的提供一种在各种不同的微胶囊的应用，如，治疗剂，食品，化妆品使用一个有前途的材料，和个人护理刺UCTS。

引言

有在微胶囊化应用从植物孢子和花粉获得使用天然植物为基础的胶囊显著的兴趣^。1-15在自然界，孢子和花粉反对恶劣的环境条件敏感的遗传物质提供保护。植物孢子和花粉的基本结构通常包括外壳层（外壁）中，内壳层（内壁），和内部细胞质材料。外壁是由称为孢粉化学鲁棒生物聚合物^1,9,10,13,16和内壁是主要由纤维素材料^16-18空胶囊可通过各种方法^7,9中分离除去细胞质材料，蛋白质，和内壁层^。2,12,16这些孢粉外壁胶囊（秒），由于其窄的尺寸分布和均匀的形态提供令人信服的替代合成密封剂^{。7,9,13,19,20}的标准化的过程，以获得来自不同植物物种，如伸筋草肝窦的发展，打开了一个广泛的药物递送，食品和化妆品等领域的微胶囊的应用的潜力^{。6,10-13,21}

为了获得肝窦，研究人员首先处理孢子和花粉与有机溶剂和碱性溶液回流以除去细胞质内容^22-25然而，剩下的胶囊结构被确定为仍然含有纤维素内壁层。为了除去此，研究人员使用盐酸，热硫酸或热磷酸在若干天^，22-25用磷酸成为SEC内壁去除的优选方法探讨了使用延长的酸性水解处理²然而，正在进行研究多年来已经表明，各种孢子和花粉具有不同程度的弹性恶劣处理我thods常用^。26,27一些孢子和花粉是完全降解并失去在强碱性溶液中的所有结构完整性，或变得严重损坏在强酸性溶液¹⁶在SEC对治疗的反应条件的变异性是由于在化学细微变化结构和物种之间的孢粉外壁材料的外壁形态²⁸由于孢粉外壁胶囊（秒）的鲁棒性的可变性，有必要以优化孢子和花粉的各种处理的条件。

从种属植物孢子clavatum已成为肝窦的最广泛研究的单一来源。因此建议，这主要是由于其广泛的可用性，成本低，单分散性，和化学坚固性^9,29孢子可以在1分组的形式来方便地收获并含有sporoplasmic内容- 2微米细胞器和biomolecules ¹¹ L. clavatum孢子已被用来作为一种天然粉末润滑剂^，30,31一个化妆品的基础上^，30和草药^32-36为广泛的治疗应用。从L.获得SEC的clavatum已被证明是更有弹性，以来自其它物种的孢子和花粉^。2处理之后的处理比肝窦，所得SEC的已显示出保留其错综复杂microridge结构和同时提供用于包囊的大的内部空腔高形态的均匀性^。7研究表明，L。 clavatum SEC的可用于药物^，10,13疫苗^，11种蛋白质^，7,14细胞^，8油^，5-7,9和食品补充剂的封装^。5,15观察SEC负载效率相对较高比常规封装材料^。7也有一些好处报道SEC的封装诸如掩盖味道^，6,10，并提供一定程度的天然保护的抗氧化作用^。12在现有的研究的能力，为L.最常用的SEC提取方法clavatum基于四个主要步骤。第一步是在50℃下在丙酮溶剂回流达12小时，脱脂孢子¹¹第二步是在120℃到12小时以除去细胞质和蛋白质材料在6％的氢氧化钾的碱性回流¹¹步骤三是在180℃下在85％的磷酸酸回流至7天以除去纤维素内壁材料¹¹第四步是一个全面的洗涤过程中使用的水，溶剂，酸和碱以除去所有剩余的非外壁材料和化学残留物。

相对于封装应用SEC提取的主要目标是产生胶囊它们是空的细胞质材料制成的，自由往复中号潜在变应原性蛋白质和形态完好^。2.37然而，从工业制造的角度来看，它也是重要的考虑附加的经济和环境因素，比如，能源效率，生产持续时间，安全性，和产生的废物。至于能量效率，兼具高的温度和长的处理时间会影响生产成本以及环境的影响。生产时间和周转时间是影响加工盈利的关键因素。特别值得关注的是，高温磷酸处理提高了安全性问题，并已知会导致腐蚀性缩放这导致在基础设施维护显著增加和延迟在批量周转时间^。38-40在可能的情况，尽量减少可能会导致所需的步数到显著减少所产生的废物。然而，常用的L的四个步骤clavatum SEC提取具有简单的EV从几十年的研究和olved已很少实际过程的优化。近日，穆恩达尔吉等人 ^，41通过系统地评估和优化的最常见的SEC提取技术之一提出在这一领域正在进行的工作显著的贡献。

在这项研究中的第一部分:孢子脱脂论证利用丙酮处理在50℃下6小时; sporoplasm和内壁去除过程证明利用85％的磷酸处理，在70℃，30小时;与水，溶剂，酸和碱充分洗涤用于演示的去除残留sporoplasmic内容;和SEC干燥证明利用对流干燥和真空烘箱干燥。在第三部分中，SEC真空装载证明利用模型蛋白的真空加载，牛血清白蛋白（BSA），其次是BSA-加载-SEC洗涤和冷冻干燥。在第四部分中，determin的BSA包封率通货膨胀论证利用离心，超声探头和紫外/可见光光谱。

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研究方案

1.孢粉外壁胶囊的提取（秒）从L. clavatum孢子

注意:美国证券交易委员会的提取过程涉及的易燃粉（L. clavatum），热腐蚀性酸和易燃溶剂，因此，适当的个人防护装备（护目镜，面罩，手套，实验室外套），使用情况获得批准的风险评估和处置由授权的实验室工作人员的化学品是必不可少的。

1. 孢子脱脂
   1. 通过使用玻璃冷凝器，循环水系统，和水浴（ 图1）准备在通风橱中回流设置。
   2. 称取百克L. clavatum孢子不要产生灰尘和任何火源。
      注意:这里使用的是商业上获得孢子（见材料清单）。
   3. 转印孢子慢慢到1L聚四氟乙烯（PTFE）的圆底烧瓶中有磁力搅拌棒。
   4. 500ml丙酮添加到在孢子聚四氟乙烯烧瓶中并轻轻摇动烧瓶中以形成均匀悬浮液。
   5. 放置在水浴集聚四氟乙烯烧瓶在50℃下，并连接到回流冷凝器。
   6. 在丙酮进行回流6小时，以200rpm搅拌，然后允许在室温冷却。
   7. 使用过滤器真空过滤纸暂停并收集孢子脱脂大（直径15厘米）的玻璃培养皿中。
   8. 通过用铝箔与溶剂蒸发的孔覆盖干燥，在室温（通风柜）的孢子。
2. 酸解
   1. 制备85％（V / V）磷酸，用去离子（DI）水和脱脂干孢子转移到一个1升的PTFE烧瓶中。
   2. 500毫升的磷酸（85％V / V）添加到脱脂孢子。
   3. 放置在水浴集聚四氟乙烯烧瓶在70℃，并连接到回流冷凝器。
   4. 在磷酸执行温和回流（70℃）30小时，然后允许凉爽室温。
   5. 通过用500毫升温去离子水稀释悬挂和使用滤纸真空过滤收集SEC的。
   6. 转移SEC的一个3升的玻璃烧杯中进行一系列洗涤的。
3. SEC清洗
   1. 放置装有肝窦在通风橱中的3升玻璃烧杯中。
   2. 800毫升热（50℃）去离子水添加到SEC的温和搅拌10分钟。
   3. 通过使用滤纸和真空过滤设置进行过滤悬浮液中。
   4. 收集SEC的在干净的3升的玻璃烧杯中。
   5. 重复步骤1.3.1。 1.3.4。五次。
   6. 添加600毫升热（45℃）丙酮SEC的温和搅拌10分钟。
   7. 通过过滤收集SEC的真空下和SEC的转移到一个干净3升玻璃烧杯中。
   8. 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。用600毫升热（50℃）的2M盐酸。
   9. 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。使用600毫升浩T（50°C）2M的氢氧化钠。
   10. 重复步骤1.3.1和1.3.4八次。
   11. 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。用600毫升热（45℃）丙酮。
   12. 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。用600毫升热（45℃）乙醇。
   13. 重复步骤1.3.6。 1.3.7和。使用800毫升热（50℃）去离子水。
   14. 转移清洁SEC的六个大的玻璃培养皿中，并干燥在通风橱中在室温下放置24小时以除去所有的水含量。
   15. 干燥在真空烘箱SEC的在60℃和1毫巴下真空10小时或直至恒重。
   16. 收集干燥的SEC的并转移到聚丙烯瓶中。
   17. 在干燥的柜子存放SEC的。

2. SEC的表征

1. 使用在不同阶段产生的孢子和肝窦进行扫描电子显微镜分析^41。
2. 使用在不同阶段产生的孢子和SEC的执行元素分析^41。 ðRY在60℃元素分析之前至少1小时的所有样品，并计算使用具有6.25乘法系数氮百分比的蛋白质含量^。11获取使用用于每个样品一式三份测量的结果。
3. 使用动态图像颗粒分析仪进行粉体学性质分析^。41
4. 使用共聚焦激光扫描显微镜扫描未处理，处理，和FITC-BSA的加载肝窦⁴¹

3.生物大分子封装真空载荷技术

1. 准备使用去离子水，并转移到50毫升聚丙烯试管的1.2ml 125毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）溶液。
2. 重150毫克肝窦的并传送到BSA溶液。
3. 涡管10分钟，以形成均匀的溶液。
4. 封面用滤纸筒。
5. 在1毫巴管转移到冻干机瓶和干燥4小时真空。
6. 执行步骤3.1到3.5。三个独立的批次。
7. 收集的BSA加载肝窦并使用研钵和杵除去团块。
8. 传送BSA的加载肝窦至50ml管中并加2ml DI水以去除残留的BSA。
9. 收集离心SEC的在4704×g离心5分钟并弃上清。
10. 重复用DI水洗涤一次。
11. 覆盖含有用滤纸BSA加载肝窦管。
12. 转移SEC的一个冰箱（-20℃），并冷冻1小时。
13. 冷冻干燥SEC的在冷冻24小时，直到店进一步鉴定。
14. 准备用同样的步骤不含BSA安慰剂SEC的如在步骤3.1。 3.13。
15. 使用相同的程序，在3.1的步骤制备FITC-BSA加载肝窦。 3.13。

4.测定包封率

1. 称量5毫克BSA-加载肝窦在2ml聚丙烯管中。
2. 加入1.4毫升磷德缓冲盐水pH为7.4（PBS）中，并涡旋5分钟。
3. 探针超声处理在40％振幅的悬浮液10秒的3个循环。
4. 过滤用0.45微米的聚醚砜（PES）过滤器解决方案。
5. 执行相同的步骤，在步骤4.1。 4.4。使用安慰剂SEC的。
6. 测量在使用安慰剂作为空白280nm的吸光度。
7. 量化使用在PBS中BSA标准曲线（200至1000微克/毫升）包封的BSA的量^。42

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结果

对于孢粉外壁胶囊简化提取工艺

该L. clavatum SEC提取由三个主要步骤实现:（1）用丙酮脱脂; （2）酸解使用磷酸85％（体积/体积）;并使用（3）广泛SEC洗涤溶剂。流线型SEC提取处理的流程在图1中提示的-我简言之，该方法涉及在50℃下用丙酮回流一个脱脂步骤6小时，然后将脱脂孢子在?...

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讨论

在这项工作中，从L. SEC提取的系统分析clavatum孢子提出并此报告表明，它能够生产更高质量的胶囊剂，同时实现¹¹的预先存在的常用协议。一个显著精简与此相反的现有协议需要高的处理温度（180℃）和一个较长的过程持续时间（7天）， ^第11的当前SEC提取处理优化主要是集中于降低酸解步骤的温度和持续时间。

脱脂，碱处理提供了从最小的孢子?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220