Cápsulas à base de plantas de extração de para aplicações de microencapsulação

Resumo

Este protocolo / manuscrito descreve um processo simplificado para a produção de cápsulas exinas esporopolenina (segundos) a partir de esporos clavatum Lycopodium e para o carregamento de compostos hidrofílicos para estes segundos.

Resumo

Microcápsulas derivados de esporos ou pólen à base de plantas fornecem uma plataforma robusta para uma gama diversificada de aplicações de microencapsulação. cápsulas esporopolenina exinas (segs) são obtidos quando os esporos ou pólen são processados ​​de modo a remover o conteúdo sporoplasmic internos. As microcápsulas ocas resultantes exibem um elevado grau de uniformidade micromerítica e reter características microestruturais intrincados relacionados com as espécies de plantas particulares. Aqui, demonstramos um processo simplificado para a produção de s a partir de esporos clavatum Lycopodium e para o carregamento de compostos hidrofílicos para estes segundos. O actual procedimento de isolamento SEC foi optimizado recentemente para reduzir significativamente os requisitos de processamento que são convencionalmente utilizados no isolamento SEC, e para assegurar a produção de microcápsulas intactas. Natural L. clavatum esporos são desengordurado com acetona, tratou-se com ácido fosfórico, e extensivamente lavadas para remover sporoplasmiconteúdo c. Depois de desengorduramento acetona, um único passo de processamento usando 85% de ácido fosfórico tem sido demonstrado para remover todo o conteúdo sporoplasmic. Ao limitar o tempo de processamento ácido para 30 horas, é possível isolar SECs limpas e evitar SEC fractura, o que tem sido demonstrado que ocorre com o tempo de processamento prolongado. lavagem extensiva com água, ácidos diluídos, diluir bases e solventes garante que todos os materiais e produtos químicos resíduos sporoplasmic são adequadamente removidos. A técnica de carga de vácuo é utilizada para carregar uma proteína modelo (Albumina de Soro Bovino) como um composto representativo hidrofílico. carregamento de vácuo proporciona uma técnica simples para carregar vários compostos, sem a necessidade de solventes agressivos ou produtos químicos indesejáveis ​​que são frequentemente necessários em outros protocolos de microencapsulação. Com base nestes protocolos de isolamento e de carregamento, segs proporcionar um material promissor para uso em uma grande variedade de aplicações de microencapsulação, tais como, agentes terapêuticos, alimentos, cosméticos, de cuidados pessoais e proddutos.

Introdução

Existe um interesse significativo em cápsulas à base de plantas naturais, obtidos a partir de esporos de plantas e pólens para uso em aplicações de microencapsulação. ^15/01 Na natureza, esporos e pólen proporcionar uma protecção para os materiais genéticos sensíveis contra condições ambientais adversas. A estrutura básica de esporos de plantas e do pólen compreende, tipicamente, uma camada de invólucro exterior (exina), uma camada de invólucro interior (intina), e o material citoplasmático interno. A exina é composta de um biopolímero quimicamente robusto ^1,9,10,13,16 referido como esporopolenina eo intina é composta principalmente de materiais celulósicos. ^16-18 cápsulas vazias podem ser isoladas por vários processos para a remoção de material de ^7,9 citoplasmática , proteínas, e a camada intine. ^2,12,16 Estas cápsulas exinas esporopolenina (segundos) fornecer uma alternativa atraente para encapsulantes sintéticos devido à sua distribuição de tamanho estreita e morfologia uniforme. ^7,9,13,19,20 adesenvolvimento de processos padronizados para a obtenção de s a partir de várias espécies de plantas, tais como Licopódio clavatum, abre a possibilidade de uma vasta gama de aplicações de microencapsulação nos campos de entrega de drogas, alimentos, cosméticos e ^6,10-13,21.

A fim de obter SECs, investigadores trataram primeiro os esporos e pólen com solventes orgânicos e submetida a refluxo em soluções alcalinas para remover o conteúdo citoplasmático. ^22-25 No entanto, a estrutura da cápsula remanescente foi determinada para conter ainda o intina camada celulósica. A fim de eliminar isto, os investigadores exploraram a utilização do tratamento de hidrólise ácida prolongada utilizando ácido clorídrico, ácido sulfúrico quente, ou ácido fosfórico quente ao longo de vários dias, ^22-25 com ácido fosfórico a tornar-se o método preferido de remoção intina SEC. ² No entanto, em curso investigação ao longo dos anos tem mostrado que vários esporos e pólenes têm diferentes graus de resistência à dura me processarthods comumente usados. ^26,27 Alguns esporos e pólenes são completamente degradada e perder toda a integridade estrutural em soluções alcalinas fortes, ou tornar-se fortemente danificada em soluções ácidas fortes. ¹⁶ A variabilidade na resposta SEC para condições de tratamento é devido a variações sutis na química estrutura e morfologia do material de exina esporopolenina exina entre espécies. ²⁸ Devido à variabilidade na robustez de cápsulas exinas esporopolenina (segundos), é necessário optimizar as condições de processamento para cada espécie de esporos e pólen.

Esporos de plantas da espécie L. clavatum tornaram-se a única fonte mais amplamente estudado da SCEE. Propõe-se que isto é principalmente devido à sua ampla disponibilidade, baixo custo, monodispersity, robustez e química ^9,29 Os esporos podem ser facilmente colhidas e conter conteúdo sporoplasmic sob a forma de agrupamentos de 1 -. 2 uM organelos celulares e biomolecules. ¹¹ L. clavatum esporos foram usados como um lubrificante em pó natural, ^30,31 base para cosméticos, ³⁰ e ^32-36 em fitoterapia para uma ampla gama de aplicações terapêuticas. O SCEE obtidos a partir de L. clavatum foram mostrados para ser mais resistente ao processamento de SECs de outras espécies de esporos e pólen. ² Após o processamento, as SECs resultantes foram mostrados para manter suas estruturas microridge intrincados e alta uniformidade morfológica, proporcionando uma grande cavidade interna para encapsulamento. ⁷ estudos indicam que o L. SECs clavatum podem ser utilizados para a encapsulação de fármacos, vacinas, ^{10,13 11} proteínas, células, ^{8 7,14} óleos, ^5-7,9 e suplementos alimentares. ^5,15 observadas eficiências de carregamento SEC são relativamente elevadas em comparação com convencional materiais de encapsulamento. ⁷ Há também um certo número de benefícios relatadosSEC para encapsulação, tais como a capacidade de mascarar o gosto, ^6,10 e para proporcionar um certo grau de protecção natural contra a oxidação. ¹² Nos estudos existentes, o método de extracção mais utilizada SEC para L. clavatum baseia-se em quatro etapas principais. O primeiro passo é de refluxo do solvente em acetona durante até 12 h a 50 ° C para secar os esporos. ¹¹ O segundo passo é a refluxo alcalina em hidróxido de potássio a 6% durante até 12 h a 120 ° C para remover citoplasmática e materiais proteicos. ¹¹ Passo três é a refluxo ácido em ácido fosfórico a 85% durante 7 dias a 180 ° C para remover o material intina celulósico. ¹¹ Passo quatro é um processo de lavagem exaustiva utilizando água, solventes, ácidos e bases para remover todo o material não-exina restante e resíduos químicos.

Os principais objetivos da extração SEC em relação a aplicações de encapsulamento são para produzir cápsulas que estão vazios de material citoplasmático, livre from proteínas potencialmente alergênicas, e morfologicamente intactos. ^2,37 No entanto, do ponto de vista de produção industrial, também é importante considerar factores económicos e ambientais adicionais, tais como, a eficiência energética, a duração de produção, segurança e resíduos resultantes. No que se refere à eficiência de energia, ambas as altas temperaturas e tempos de processamento longos afecta os custos de produção, bem como o impacto ambiental. duração produção e tempo de resposta são factores-chave que influenciam a rentabilidade de processamento. Particularmente preocupante é que o processamento de ácido fosfórico de alta temperatura aumenta a questões de segurança e é conhecido por resultar em escamação corrosivo que leva a aumentos significativos na manutenção da infra-estrutura e atrasos em tempos de rotação lote ^38-40. Sempre que possível, minimizando o número de passos necessários pode levar a redução significativa dos resíduos produzidos. No entanto, a normalmente utilizada processo de quatro passos de L. extração clavatum SEC tem simplesmente evolved de décadas de pesquisa e teve pouco otimização processo real. Recentemente, Mundargi et al., ⁴¹ fez uma contribuição significativa para os trabalhos em curso neste domínio, através da avaliação e otimização de uma das técnicas de extração SEC mais comumente reportados de forma sistemática.

Na primeira secção deste trabalho: desengorduramento de esporos é demonstrado utilizando processamento de acetona a 50 ° C durante 6 horas; sporoplasm procedimentos de remoção e intina são demonstradas utilizando processamento de ácido fosfórico a 85%, a 70 ° C durante 30 h; lavagem extensiva com água, solventes, ácido, e a base é utilizada para demonstrar a remoção de conteúdos sporoplasmic residuais; e SEC secagem é demonstrada utilizando secagem por convecção e vácuo secagem em estufa. Na terceira secção, SEC carregamento vácuo é demonstrada utilizando o carregamento de vácuo de um modelo de proteína, albumina de soro bovino (BSA), seguido de BSA-carregado-SEC lavagem e liofilização. Na quarta seção, a determinção da eficiência de encapsulamento de BSA é demonstrada utilizando centrifugação, a sonda de ultra-sons, e espectrometria de UV / Vis.

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Protocolo

1. Extração de esporopolenina exina Cápsulas (segundos) a partir de L. clavatum Esporos

Nota: O processo de extração SEC envolve um pó inflamável (L. clavatum), ácidos corrosivos picantes, e solventes inflamáveis, equipamentos, portanto, adequada proteção individual (óculos de proteção, máscara, luvas, jaleco), avaliação de risco aprovada em uso e descarte de produtos químicos por pessoal de laboratório autorizado é essencial.

1. Spore Desengordurante
   1. Prepara-se uma set-up refluxo numa câmara exaustora, utilizando um condensador de vidro, sistema de circulação de água, e banho de água (Figura 1).
   2. Pesar 100 g L. esporos clavatum sem criar poeira e longe de qualquer fonte de ignição.
      Nota: Os esporos aqui utilizados foram obtidos comercialmente (Veja Lista de Materiais).
   3. Transferência de esporos lentamente a uma de 1 L de politetrafluoretileno (PTFE) frasco de fundo redondo com uma barra de agitação magnética.
   4. Adicionar 500 ml de acetona para os esporos dobalão de PTFE e agitar suavemente o frasco para formar uma suspensão homogénea.
   5. Colocar o balão de PTFE no conjunto do banho de água a 50 ° C e conectar-se a um condensador de refluxo.
   6. Realizar a refluxo em acetona durante 6 horas com agitação a 200 rpm e, em seguida, deixa-se arrefecer à temperatura ambiente.
   7. Filtrar a suspensão, com papel de filtro sob vácuo e recolher os esporos desengordurados em grandes (15 cm de diâmetro) placas de petri de vidro.
   8. Secam-se os esporos à temperatura ambiente (hotte) por revestimento com folha de alumínio com furos para a evaporação do solvente.
2. acid�ise
   1. Prepare a 85% (v / v) de ácido fosfórico com água desionizada (Dl) e transferir os esporos secos desengordurados para um balão de 1 L de PTFE.
   2. Adicionar 500 ml de ácido fosfórico (85% v / v) para os esporos desengordurados.
   3. Colocar o balão de PTFE em conjunto um banho de água a 70 ° C e conectar-se a um condensador de refluxo.
   4. Realizar refluxo suave (70 ° C) em ácido fosfórico durante 30 h e, em seguida, para permitiresfriar em temperatura ambiente.
   5. Diluir a suspensão utilizando água DI 500 ml quente e recolher os SECs por filtração a vácuo utilizando papel de filtro.
   6. Transferir a segundos para uma proveta de vidro de 3 L para executar uma série de lavagens.
3. SEC lavar roupa
   1. Colocar a proveta de vidro de 3 L contendo SECs numa hotte.
   2. Adicionar (50 ° C) de água DI 800 ml quente para os SECs com agitação suave durante 10 min.
   3. Filtrar a suspensão usando papel de filtro e uma filtração a vácuo set-up.
   4. Recolher o SECs em 3 L copo de vidro limpo.
   5. Repita os passos 1.3.1. a 1.3.4. cinco vezes.
   6. Adicionar acetona 600 ml quente (45 ° C) para os SECs com agitação suave durante 10 min.
   7. Recolher os SECs por filtração sob vácuo e transferir os segundos para a 3 L copo de vidro limpo.
   8. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando-se 600 ml quente (50 ° C) de ácido clorídrico 2M.
   9. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando 600 ml hot (50 ° C) a 2 M de hidróxido de sódio.
   10. Repita os passos 1.3.1 e 1.3.4 oito vezes.
   11. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando-se 600 ml quente (45 ° C) de acetona.
   12. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando-se 600 ml quente (45 ° C) de etanol.
   13. Repita os passos 1.3.6. e 1.3.7. utilizando 800 ml quente (50 ° C) de água DI.
   14. Transferir os SECs limpas para seis grandes placas de petri de vidro e seco numa hote à temperatura ambiente durante 24 horas para remover todo o conteúdo de água.
   15. Secam-se as SECs num forno de vácuo a 60 ° C e 1 mbar de vácuo durante 10 h ou até peso constante.
   16. Recolher o SECs seco e transferir para um frasco de polipropileno.
   17. Armazenar o SECs em um armário seco.

2. Caracterização do SECs

1. Realizar electrónica de varrimento análise microscópica utilizando ⁴¹ esporos e SECs produzidas em diferentes fases.
2. Realizar análise elementar ⁴¹ usando esporos e SECs produzidas em diferentes fases. DRY todas as amostras a 60 ° C durante pelo menos 1 hora antes da análise elementar e calcular o teor de proteína usando por cento de azoto, com um factor de multiplicação de 6,25. ¹¹ obter resultados utilizando medições triplicadas para cada amostra.
3. Realizar uma análise de propriedades micromerítica usando um analisador de imagem de partículas dinâmico. ⁴¹
4. Digitalizar não transformados, processados e SECs FITC-BSA-carregados usando microscopia confocal de varredura a laser. ⁴¹

3. Biomacromolecule Encapsulation por vácuo Carregando Técnica

1. Preparar 1,2 ml solução de 125 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) usando água Dl e transferir para um tubo de polipropileno de 50 ml.
2. Pesar 150 mg de segundos e transferir para a solução de BSA.
3. Vortex o tubo durante 10 minutos para formar uma solução homogénea.
4. Cobrir o tubo com papel de filtro.
5. Transferir o tubo para um frasco de secador por congelação e seco durante 4 horas com vácuo a 1 mbar.
6. Execute as etapas de 3.1para 3,5. para três lotes independentes.
7. Recolher o SECs BSA-carregado e remover os aglomerados usando um almofariz e pilão.
8. Transfira os SECs BSA-carregados para um tubo de 50 ml e adicionar 2 ml de água DI para remover a BSA residual.
9. Recolher os SECs por centrifugação a 4704 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
10. Repetir a lavagem com água DI vez.
11. Cubra o tubo contendo SECs BSA-carregado usando papel de filtro.
12. Transferir os segundos para um congelador (-20 ° C) e congelar durante 1 h.
13. Congelar secar o SECs, durante 24 horas e armazenar em um congelador até posterior caracterização.
14. Prepare os SECs placebo sem BSA utilizando o mesmo processo que nos passos 3.1. a 3.13.
15. Prepare os FITC-BSA SECs carregados usando o mesmo processo que nos passos 3.1. a 3.13.

4. Determinação da eficiência de encapsulação

1. Pesar 5 mg de SECs BSA-carregados em 2 ml de tubos de polipropileno.
2. Adicionar 1,4 ml de fosfate solução salina tamponada com pH 7,4 (PBS) e agitar com vortex durante 5 min.
3. Sonda sonicar a suspensão a 40% de amplitude durante 3 ciclos de 10 seg.
4. Filtrar a solução através de um filtro de 0,45 um de polietersulfona (PES).
5. Realizar o mesmo procedimento tal como nos passos 4.1. para 4,4. usando SECs placebo.
6. Medir a absorvância a 280 nm, utilizando placebo como um branco.
7. Quantificar a quantidade de BSA encapsulada utilizando uma curva padrão de BSA (200 a 1000 ug / ml) em PBS ^42.

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Resultados

Processo de Extracção simplificado para esporopolenina exina Cápsulas

O L. extracção clavatum SEC foi conseguida por três etapas principais: (1) Desengordurante usando acetona; (2) acidólise com ácido fosfórico a 85% (v / v); e (3) lavagem SEC extensa utilização de solventes. O fluxo do processo de extracção SEC simplificado é apresentado na Figura 1 A -. I Resu...

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Discussão

Neste trabalho, uma análise sistemática da extração SEC de L. esporos clavatum é apresentada e este relatório mostra que é possível produzir cápsulas de qualidade superiores, ao mesmo tempo alcançar uma simplificação significativa do pré-existente protocolo vulgarmente usado. ¹¹ Em contraste com o protocolo já existente que requer uma temperatura elevada de processo (180 ° C) e uma longa duração do processo (7 dias), a corrente ¹¹ SEC optimização processamento e...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220