마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 추출 공장 기반 캡슐

요약

이 프로토콜 / 원고는 석송의 포자에서 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 생산을위한 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스에 대해 설명합니다.

초록

식물 기반 포자 또는 꽃가루에서 파생 된 마이크로 캡슐은 마이크로 캡슐화 응용 프로그램의 다양한 범위에 대한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 내부 sporoplasmic 내용을 제거하기 위해 포자 또는 꽃가루가 처리 될 때 Sporopollenin의 exine 캡슐 (SEC 초)을 얻을 수있다. 얻어진 중공의 마이크로 캡슐이 균일 micromeritic 고도를 나타내고, 특히 식물 종에 관련된 복잡한 미세 기능을 유지한다. 여기서, 우리는 석송의 포자에서 SEC 초 생산을 위해 이러한 SEC 초에 친수성 화합물의 로딩을위한 간소화 된 프로세스를 보여줍니다. 현재 SEC 분리 과정은 최근 크게 종래 SEC 분리에 사용되는 프로세싱 요구를 감소하고, 본래 마이크로 캡슐의 제조를 위해 최적화되어있다. 자연 L. 속 clavatum 포자 인산으로 처리하여, 아세톤으로 탈지 광범위 sporoplasmi를 제거하는 세척C 내용. 아세톤으로 탈지 후, 85 % 인산을 사용하여 단일 공정 단계 sporoplasmic 모든 내용을 제거하는 것으로 나타났다. 30 시간에 산 처리 시간을 제한함으로써, 깨끗한 SEC 초를 분리 및 장기간의 처리 시간이 발생하는 것으로 나타났다 SEC의 파쇄를 방지 할 수있다. 물 광범위한 세척, 산을 희석 기지를 희석 용매 모든 sporoplasmic 물질 및 화학 잔류 물이 적절하게 제거되었는지 확인합니다. 진공로드 기법 대표적인 친수성 화합물로서 모델 단백질 (소 혈청 알부민)을로드하는 데에 이용된다. 진공로드들은 다른 마이크로 캡슐화 프로토콜에서 요구되는 가혹한 용매 또는 바람직하지 않은 화학 물질 없이도 다양한 화합물을로드하는 간단한 기술을 제공한다. 이러한 분리 및로드 프로토콜을 기반으로 초 남음 마이크로 캡슐화와 같은 응용 프로그램, 치료제, 식품, 화장품의 다양한 범위에서 사용하기에 유망한 재료 및 퍼스널 케어 자극을 제공ucts을.

서문

이 마이크로 캡슐화 응용 프로그램에서 사용하기 위해 식물의 포자와 꽃가루에서 얻은 천연 식물성 캡슐에 상당한 관심이. 인 자연에서 ^1-15, 포자 및 꽃가루는 가혹한 환경 조건에 대한 민감한 유전 물질에 대한 보호를 제공합니다. 식물 포자 꽃가루의 기본 구조는 통상적으로 외부 쉘 층 (exine) 내부 쉘층 (intine) 내부의 세포질 물질을 포함한다. exine는 sporopollenin이라 화학적 강력한 ^1,9,10,13,16 생체 고분자로 구성되고 intine 주로 셀룰로오스 재료로 구성된다. ^16-18 빈 캡슐 ^7,9 다양한 공정에 의해 단리 할 수 세포질 물질을 제거하기위한 , 단백질, 그리고 intine 층. ^2,12,16이 sporopollenin exine 캡슐 (초 남음) 그들의 좁은 크기 분포 균일 한 형태로 합성 봉지에 강력한 대안을 제공합니다. ^{7,9,13,19,20에게를}이러한 석송 같은 다양한 식물 종으로부터 SEC 초를 얻기 표준화 된 프로세스의 개발은, 약물 전달, 식품, 화장품 등의 분야에서 마이크로 캡슐화 광범위한 응용 가능성을 연다. ^6,10-13,21

SEC 초를 얻기 위해, 연구자들은 제 1 유기 용매와 포자 및 꽃가루를 처리 한 세포 내 내용물을 제거하는 알칼리 용액에서 환류시켰다. ^{22-25하지만,} 나머지 캡슐 구조가 여전히 셀룰로오스 intine 층을 포함하도록 결정 하였다. 이것을 제거하기 위해, 연구자들은 SEC의 intine 제거 바람직한 방법되고 인산으로 몇 일 동안 ^22-25 염산, 뜨거운 황산, 또는 뜨거운 인산을 사용하여 장시간 산성 가수 분해 처리의 사용을 탐구. ⁽²⁾ 그러나, 지속적인 수년에 걸쳐 연구는 다양한 포자와 꽃가루가 날 처리 가혹한에 탄력성의 다른 학위를 가지고 있음을 보여 주었다thods 일반적으로 사용. ^{(26, 27)} 일부 포자와 꽃가루가 완전히 분해하고 강한 알칼리 용액에서 모든 구조적 무결성을 잃고, 또는 무겁게 강한 산성 용액에 손상.가 ¹⁶ 처리 조건에 SEC 응답의 변화는 화학 물질의 미묘한 변화에 기인 구조 및 화학 종 사이의 sporopollenin의 exine 재료 exine 형태. ²⁸ 인해 sporopollenin exine 캡슐 (SEC 초)의 견고성의 변동, 포자 꽃가루 각 종의 처리 조건을 최적화 할 필요가있다.

L. 종의 식물 포자 속 clavatum는 SEC 초 가장 널리 연구 단일 소스되고있다. . 이는이 때문에 널리 이용 가능성, 낮은 비용, 단 분산 및 화학적 안정성에 주로 제안된다 ^{9, 29} 포자가 쉽게 하나의 그룹의 형태 sporoplasmic 내용을 수확하여 포함 할 수있다 - 2 ㎛의 세포 소기관 및 Biomolecules. ¹¹ L. 속 clavatum 포자 치료 다양한 용도 천연 분말 윤활제 화장품 ^{30,31베이스, 30} 및 ^32-36 한방에 사용되어왔다. L.로부터 얻어진 SEC 초 속 clavatum 포자 및 처리 후의 ^{꽃가루.이} 다른 종으로부터의 SEC 초 이상 처리 탄력적으로 도시 된, 결과 SEC 초들은 복잡 microridge 구조 및 높은 형태 균일 캡슐화 넓은 내부 공동을 제공하는 동시에 유지하는 것으로 나타났다. ⁷ 연구는 것을 나타냅니다 L. 속 clavatum SEC 초 마약, ^{10, 13} 백신, ¹¹ 단백질, ^{7, 14} 셀, ⁸ 오일, ^5-7,9 및 식품 보조제의 캡슐화에 사용할 수 있습니다. ^5,15 관찰 SEC 적재 효율은 기존에 비해 상대적으로 높은 캡슐화 재료. ^{7은도보고} 혜택을 제공하고 있습니다SEC 밀봉하는 등, ^{6,10 맛을} 마스킹하기위한 산화에 대하여 천연 어느 정도의 보호를 제공한다. 기존의 연구에서 ¹² 능력 L. 위해 가장 일반적으로 사용되는 SEC 추출법 등 속 clavatum은 네 가지 주요 단계를 기반으로합니다. 단계 하나는 포자를 탈지 50 ° C에서 최대 12 시간 동안 아세톤 용매 환류입니다. ¹¹ 2 단계는 세포질과 단백질 물질을 제거하기 위해 120 ° C에서 최대 12 시간 동안 6 % 수산화 칼륨의 알칼리성 환류입니다. ¹¹ 단계 세 180 ° C에서 최대 7 일 동안 85 % 인산에 산 환류는 셀룰로오스 intine 재료를 제거하는 것이다. ¹¹ 4 단계가 나머지 비 exine 물질을 제거하기 위해 물, 솔벤트, 산, 염기를 사용하는 포괄적 인 세척 공정 인 화학 잔류 물.

밀봉 애플리케이션 관련 SEC 추출의 주된 목적은, 자유를 이리저리 세포질 물질의 비어있는 캡슐을 제조한다잠재적 인 알레르겐 단백질이 M 및 형태 학적 손상. ^2,37을 그러나, 산업 제조의 관점에서, 그러한 에너지 효율, 제조 시간, 안전 및 얻어진 폐기물 추가적인 경제적, 환경 적 요인을 고려하는 것도 중요하다. 에너지 효율에 관해서, 높은 온도와 긴 처리 시간을 모두 생산 비용뿐만 아니라 환경에 미치는 영향을 미칩니다. 생산 기간 및 소요 시간 처리 수익성을 좌우하는 중요한 요소이다. 특히 관심 고온 인산 처리 안전 문제를 증가시키고, 일괄 처리 시간에서 상당한 인프라 정비의 증가 지연에 이르게 부식성 스케일링 될 것으로 알려져 있다는 것이다. ^38-40 가능한 경우 발생할 수 필요한 단계의 수를 최소화 크게 생성 된 폐기물을 감소시킨다. 그러나, 일반적으로 L.의 4 단계 프로세스를 사용 속 clavatum SEC 추출은 단순히 EV가연구의 수십 년에서 olved 거의 실제 프로세스 최적화를했다. 최근 Mundargi는 등. ^(41)은 체계적으로 평가하고 가장 일반적으로보고 된 SEC 추출 기술 중 하나를 최적화함으로써이 분야에서 진행중인 작업에 상당한 기여를했다.

본 연구의 제 1 섹션에서 : 포자 탈지 6 시간 동안 50 ℃에서 아세톤 처리를 이용하여 설명된다; sporoplasm 및 intine 제거 절차는 30 시간 동안 70 ° C에서 85 % 인산 처리를 이용하여 증명된다; 물, 용매, 산 및 염기와 광범위한 세정 잔류 sporoplasmic 콘텐츠의 제거를 입증하기 위해 사용된다; 삼성 전자의 건조는 대류 건조 및 진공 오븐 건조를 이용하여 설명된다. 세 번째 섹션에서 삼성 진공 로딩이 모델 단백질의 진공로드를 이용하여 증명하고, 다음에 소 혈청 알부민 (BSA), 세척 및 동결 건조를 BSA는 --SEC를로드. 네 번째 섹션에서 determinBSA에 캡슐화 효율 ATION는 초음파 프로브를 원심 분리를 이용하고, UV / 비스 분석법 설명된다.

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프로토콜

L.에서 Sporopollenin Exine 캡슐 1. 추출 (SEC 초) 속 clavatum 포자

주 : SEC 추출 과정의 가연성 분말 (L. 속 clavatum), 고온 부식 산, 가연성 용제, 따라서 적절한 개인 보호 장비 (고글, 안면 마스크, 장갑, 실험실 코트), 사용에 승인 된 위험 평가 및 처분을 포함한다 공인 실험실 직원이 화학 물질은 필수적이다.

1. 포자 탈지
   1. 유리 냉각기, 물 순환 시스템 및 수조 (도 1)를 사용하여 흄 후드의 환류 설정을 준비한다.
   2. 100g L. 무게 떨어진 점화원에서 먼지를 만들고없이 속 clavatum 포자.
      참고 : 상업적으로 얻을 수 있었다 여기에 사용 된 포자 (자료 목록을 참조하십시오).
   3. 자기 교반 막대로 1 L의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 둥근 바닥 플라스크에 천천히 전송 포자.
   4. 의 포자에 500 ml의 아세톤 추가PTFE 플라스크 균질 현탁액을 부드럽게 진탕 플라스크.
   5. 50 ° C에서 물 목욕 세트의 PTFE 플라스크를 놓고 환류 냉각기에 연결합니다.
   6. 200 rpm으로 교반하면서 6 시간 동안 아세톤에 환류를 수행 한 다음 실온에서 냉각 할 수 있습니다.
   7. 진공 상태에서 여과지를 사용하여 현탁액을 여과하고, 대형 (15cm 직경) 유리 페트리 접시에 탈지 포자를 수집합니다.
   8. 용매 증발을위한 구멍이있는 알루미늄 호일로 덮어 실온 (흄 후드)에서 포자를 건조.
2. 분해법
   1. 85 % 탈 (DI) 물 (v / v)의 인산을 준비하고 1 L의 PTFE 플라스크에 탈지 건조 포자를 전송합니다.
   2. 탈지 포자에 인산 (85 % v / v)의 500 ML을 추가합니다.
   3. 70 ℃에서 수욕 세트의 PTFE 플라스크를 놓고 환류 응축기에 연결한다.
   4. 30 시간 동안 인산에 부드러운 환류 (70 ° C)을 수행 한 다음에 허용실온에서 냉각.
   5. 500 ml의 따뜻한 DI 물을 사용하여 상기 현탁액을 희석하고, 필터 종이를 사용하는 진공 여과에 의해 수집 SEC 초.
   6. 세척액의 시리즈를 수행하기 위해 세 L 유리 비커에 SEC 초 옮긴다.
3. 삼성 세탁기
   1. 흄 후드에서 SEC 초를 포함하는 3 L의 유리 비커를 놓습니다.
   2. 10 분 동안 부드러운 교반과 SEC 초에 800 ml의 고온 (50 ° C) DI 물을 추가합니다.
   3. 여과지 진공 여과 설정을 사용하여 상기 현탁액을 필터.
   4. 깨끗한 3 L의 유리 비커에 SEC 초를 수집합니다.
   5. 반복 1.3.1 단계를 반복합니다. 1.3.4합니다. 다섯 번.
   6. 10 분 동안 부드러운 교반과 SEC 초에 600 ml의 고온 (45 ° C) 아세톤을 추가합니다.
   7. 진공하에 여과에 의해 SEC 초를 수집하고 깨끗한 3 L의 유리 비커에 SEC 초를 전송합니다.
   8. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (50 ℃) 2 M 염산을 사용.
   9. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 호 600 ml에 사용t (50 °의 C) 2 M 수산화 나트륨.
   10. 반복 1.3.1과 1.3.4 8 번 단계를 반복합니다.
   11. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (45 ° C) 아세톤을 사용.
   12. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 600 ㎖ (45 ° C) 에탄올을 사용.
   13. 반복 1.3.6 단계를 반복합니다. 및 1.3.7. 핫 800 ㎖ (50 ℃)의 DI 물을 사용.
   14. 모든 수분을 제거하기 위해 24 시간 동안 실온에서 흄 후드에서 여섯 대형 유리 페트리 접시 건조에 깨끗한 SEC 초를 전송합니다.
   15. 60 ℃에서 10 시간 또는 일정 중량까지 1 밀리바의 진공에서 진공 오븐에서 건조 SEC 초.
   16. 건조 SEC 초를 수집하고 폴리 프로필렌 병에 전송할 수 있습니다.
   17. 건조 캐비닛에 SEC 초를 저장합니다.

SEC 초 2. 특성

1. 다른 단계에서 생성 된 포자와 SEC 초를 사용하여 주사 전자 현미경 분석 ^{(41)을 수행합니다.}
2. 다른 단계에서 생성 된 포자와 SEC 초를 사용하여 원소 분석 ^{(41)을 수행합니다.} 디스피 원소 분석 전에 최소한 1 시간 동안 60 ° C에서 모든 샘플은 6.25의 곱셈과 퍼센트 질소를 이용하여 단백질 함량을 ^{계산한다.도 11는} 각 샘플에 대한 삼중 측정하여 결과를 얻을.
3. 동화상 입자 분석기를 사용 micromeritic 특성 분석을 수행. ⁴¹
4. 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 미처리 스캔 처리 및 FITC-BSA로드 된 SEC 초. ⁴¹

진공로드 기술 3. 생체 거대 분자 캡슐화

1. 50 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 DI 물과 전달을 이용하여 125 ㎎을 1.2 ㎖ / ml의 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 제조 하였다.
2. SEC 초 150 mg의 무게를 측정하고, BSA 용액에 전송할 수 있습니다.
3. 균질 한 용액을 형성하기 위해 10 분 동안 튜브를 소용돌이.
4. 여과지를 이용하여 튜브를 커버.
5. 1 밀리바에서 진공 4 시간 동안 동결 건조기 플라스크 건조에 튜브를 전송합니다.
6. 3.1 단계 수행3.5. 3 개의 독립적 인 배치합니다.
7. BSA에로드 SEC 초를 수집하고 박격포와 유 봉을 사용하여 응집체를 제거합니다.
8. 50 ML 튜브에 BSA-로드 SEC 초를 전송하고 잔여 BSA를 제거하는 2 ml의 탈 이온수를 추가합니다.
9. 5 분 4704 XG에서 원심 분리하여 SEC 초를 수집하고 상층 액을 버린다.
10. 한 번 탈 이온수로 세척을 반복합니다.
11. 여과지를 사용하여 BSA로드 SEC 초를 포함하는 튜브를 커버.
12. 냉동실 (-20 ° C)에 SEC 초를 전송하고 1 시간 동안 동결.
13. 추가로 특성화 될 때까지 냉장고에 24 시간 저장을위한 SEC 초 건조 동결.
14. 단계 3.1에서와 동일한 절차를 사용하여 BSA없는 위약 SEC 초를 준비한다. 3.13에.
15. 단계 3.1에서와 동일한 절차를 이용하여 FITC-BSA로드 SEC 초를 준비한다. 3.13에.

캡슐화 효율 4. 결정

1. 2 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 BSA-로드 SEC 초 5 mg의 무게.
2. 1.4 ml의 포스 추가테 5 분 동안 생리 식염수의 pH가 7.4 (PBS)와 소용돌이를 버퍼링.
3. 프로브는 10 초 3 회 40 %의 진폭의 현탁액을 초음파 처리.
4. 0.45 ㎛의 폴리 에테르 설폰 (PES) 필터를 사용하여 상기 용액을 필터.
5. 단계 4.1에서와 동일한 절차를 수행한다. 4.4. 위약 SEC 초를 사용.
6. 공백으로 위약을 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한다.
7. BSA의 양은 PBS에서 BSA 표준 곡선 (200 내지 1,000 μg의 / ㎖)을 사용하여 캡슐화 정량화. ⁴²

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결과

Sporopollenin Exine 캡슐에 대한 간소화 된 추출 과정

L. 속 clavatum SEC 추출은 세 가지 주요 단계에 의해 달성되었다 : (1) 아세톤을 사용하여 탈지; (2) 분해법은 인산에게 85 %를 사용 (v / v)의; (3) 광범위한 SEC 세척 용제를 사용. 유선형 SEC 추출 처리의 흐름은도 1 (A)에 제시된다 -. I 간단히,...

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토론

이 작품, L.에서 SEC 추출의 체계적인 분석 속 clavatum 포자 제시이 보고서는 또한 높은 공정 온도 (180 ° C)을 필요로하는 기존의 프로토콜과 대조적으로, 기존의 일반적으로 사용되는 프로토콜. ¹¹ 크게 간소화를 달성하면서 고품질의 캡슐을 제조 할 수 있음을 표시하고, 긴 처리 시간 (7 일) ¹¹ 현재 SEC 추출 처리 최적화 주로 분해법 단계의 온도 및 시간을 절감에 집중 하...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220