マイクロカプセル化アプリケーション用の抽出プラントベースのカプセル

要約

このプロトコル/原稿がヒカゲノカズラ胞子からのスポロポレニン外膜カプセル（秒）を製造するためのこれらのSECSへの親水性化合物の搬入のための合理化されたプロセスを説明します。

要約

植物ベースの胞子や花粉由来マイクロカプセルは、マイクロカプセル化アプリケーションの多様な範囲のための堅牢なプラットフォームを提供します。内部sporoplasmic内容を削除するように胞子や花粉が処理されるときにスポロポレニン外膜カプセル（秒）が得られます。得られた中空マイクロカプセルはmicromeritic高度の均一性を示し、特定の植物種に関連する複雑な微細構造の特徴を保持しています。ここで、我々はヒカゲノカズラ胞子からSECSの生産のため、これらSECSへの親水性化合物の搬入のための合理化プロセスを示しています。現在のSEC分離手順は、最近かなり従来SEC分離に使用される処理要件を低減するために、無傷のマイクロカプセルの製造を確実にするために最適化されています。ナチュラルL. clavatumの胞子を、アセトンで脱脂し、リン酸で処理し、そして広範囲sporoplasmiを除去するために洗浄されていますCの内容。アセトン脱脂した後、85％リン酸を用いて、単一の処理ステップは全てsporoplasmicの内容を削除することが示されています。 30時間に酸処理時間を制限することにより、クリーン秒を分離し、長時間の処理時間で発生することが示されたSECの破壊を回避することができます。豊富な水で洗浄し、酸を希釈し、拠点を希釈し、溶媒をすべてsporoplasmic材料と化学残留物が十分に除去されることを保証します。真空装填技術は、代表的な親水性化合物として、モデルタンパク質（ウシ血清アルブミン）をロードするために利用されます。真空装填は、多くの場合、他のマイクロカプセル化プロトコルで必要とされる過酷な溶剤または望ましくない化学薬品を必要とせずに様々な化合物をロードするための簡単な技術を提供します。これらの単離およびロードのプロトコルに基づいて、SECSは、治療薬、食品、化粧品、およびパーソナルケアのprod、などのマイクロカプセル化アプリケーションの多様な範囲内で使用するための有望な材料を提供しますUCTS。

概要

マイクロカプセル化の用途に使用するための植物の胞子や花粉から得られる天然植物ベースのカプセルで大きな関心があります。自然界では^1月15日 、胞子および花粉は、過酷な環境条件に対して敏感な遺伝物質のための保護を提供します。植物の胞子および花粉の基本的な構造は、典型的には、外殻層（外膜）、内側シェル層（内膜）、内部細胞質の材料を含みます。外膜は、化学的に頑強なバイオポリマー^1,9,10,13,16から構成されてスポロポレニンと呼ばれ、内膜は、セルロース系材料から主に構成されている^。16-18空カプセルは、細胞質物質を除去するための様々なプロセス^7,9によって単離することができます、タンパク質、及び内膜層^。2,12,16これらのスポロポレニン外膜カプセル（秒）は、それらの狭いサイズ分布および均一な形態に合成封止材への魅力的な代替手段を提供する^{。7,9,13,19,20}このようなヒカゲノカズラなど様々な植物種からSECSを得るために、標準化されたプロセスの開発は、マイクロカプセル化薬物送達の分野での応用、食品、および化粧品の広い範囲の可能性を開きます^{。6,10-13,21}

秒を得るために、研究者らは、第一の有機溶媒で胞子および花粉を処理し、細胞質の内容物を除去するために、アルカリ性溶液中で還流した^{。22-25しかしながら} 、残りのカプセル構造体は依然としてセルロース内膜層を含むことが決定されました。これを除去するために、研究者らは、しかし^、2リン酸と^{22〜25は、SEC}内膜除去の好ましい方法になって、数日間にわたって、塩酸、熱硫酸、または熱リン酸を用いた長期の酸加水分解処理の使用を検討し、進行中年間の研究は、様々な胞子、花粉が私を処理する過酷に弾力性の異なる程度を持っていることが示されていますthods一般的に使用される^。26,27一部の胞子や花粉が完全に分解され、強いアルカリ性溶液中のすべての構造的完全性を失う、または重く強い酸性溶液中に損傷している。となる¹⁶処理条件にSEC応答の変動は、化学における微妙な変化に起因しています構造と種間スポロポレニン外膜材料の外膜形態^。28によりスポロポレニン外膜カプセル（秒）の堅牢性の変動には、胞子や花粉のそれぞれの種の処理条件を最適化する必要があります。

L.の種からの植物の胞子clavatumは SECSの最も広く研究されている単一のソースとなっています。 。その広く普及、低コスト、単分散性、および化学的堅牢性に主であることが提案されている^9,29胞子が簡単に1のグループ分けの形でsporoplasmic内容を採取し、含まれていることができます- 2μmの細胞小器官およびb^{iomolecules。11} L. clavatum胞子は、治療用途の広い範囲のための自然な粉末潤滑剤、化粧品の^30,31のベース^、30通りと漢方薬^32-36で使用されてきました。 L.から得られたSECS clavatumの胞子および花粉の他の種からの秒以下の処理に対してより弾力的であることが示されている^。2処理後、得られたSECSは、カプセル化のために、大きな内部空洞を提供しながら、それらの複雑なmicroridge構造と高い形態学的均一性を維持することが示されている^。7研究はことを示しているL. clavatum SECSドラッグは^、10,13ワクチン^、11タンパク質^、7,14細胞^、8油^、5-7,9および栄養補助食品のカプセル化に使用することができます^。5,15観測SECローディング効率は、従来に比べて比較的高いですカプセル化材料^。7はまた^、報告された多くの利点がありますSECのカプセル化など^、6,10の味をマスクすると、酸化に対する自然ある程度の保護を提供する。既存の研究では^12の能力、L.のための最も一般的に使用されるSECの抽出方法として、 clavatumは、4つの主要なステップに基づいています。ステップ1は、胞子を脱脂するために50℃で最大12時間、アセトン中での溶媒の還流である^。11ステップ2は、細胞質およびタンパク質性物質を除去するために、120℃で最大12時間、6％の水酸化カリウムでアルカリ性の還流である^。11ステップ3つのセルロース内膜物質を除去するために180℃で最大7日間、85％リン酸中の酸還流で¹¹ステップ4つのすべての残りの非外膜材料を除去するために水、溶媒、酸、および塩基を用いて総合的な洗浄工程でありますそして残留農薬。

カプセル化の用途に関連してSEC抽出の主な目標は、無料のあちこちに、細胞質材料の空であるカプセルを製造するためにあります潜在的にアレルゲン性タンパク質M、および形態学的にインタクト^。2,37とが、工業生産の観点から、そのようなエネルギー効率、製造時間、安全性、及び得られた廃棄物などの追加の経済的および環境的要因を考慮することも重要です。エネルギー効率に関しては、高温及び長い処理時間の両方が生産コストだけでなく、環境負荷に影響を与えます。生産期間と所要時間は、処理の収益性に影響を与える重要な要因です。特に懸念されるのは高温のリン酸処理は安全性の問題が増加し、一括所要時間の大幅なインフラ整備の増加や遅延につながる腐食性のスケーリングをもたらすことが知られているということです^。38-40可能であれば、つながる可能性があり、必要なステップの数を最小限に抑えます大幅に生産廃棄物の削減します。しかしながら、一般的にLの4段階のプロセスを使用しclavatum SEC抽出は、単にEVを持っています研究の数十年からolvedと少しの実際のプロセスの最適化を持っていました。最近、Mundargi らは ^、41は、体系的に最も一般的に報告SEC抽出技術のいずれかを評価し、最適化することにより、この分野で進行中の作業に多大な貢献をしました。

この研究の最初のセクションで：胞子脱脂6時間50℃でアセトン処理を利用することが実証されています。胞子原形質および内膜除去手順は、30時間、70℃で85％のリン酸処理を利用して実証されています。水、溶媒、酸、および塩基でよく洗浄して残留sporoplasmic内容物の除去を実証するために使用されます。およびSECの乾燥は、対流乾燥、真空オーブン乾燥を利用することが実証されています。 3番目のセクションでは、SECの真空装填は、BSA-ロード-SEC洗浄および凍結乾燥が続くモデルタンパク質、ウシ血清アルブミン（BSA）、の真空装填を利用実証されています。 4番目のセクションでは、determinBSAのカプセル化効率のationがプローブ超音波処理、遠心分離を利用した実証、およびUV /可視分光分析されます。

プロトコル

L.からスポロポレニン外膜カプセルの1の抽出（SECS） clavatum胞子

注：SEC抽出プロセスはの可燃性粉末（L.のclavatum）、ホット腐食性の酸、及び可燃性の溶剤、したがって、適切な個人用保護具（ゴーグル、フェイスマスク、手袋、白衣）、使用上の承認されたリスクアセスメント、および廃棄を伴います許可された実験室の担当者による化学物質が不可欠です。

1. 胞子脱脂
   1. ガラス冷却器、水循環システム、及び水浴（ 図1）を用いて換気フード中で還流セットアップを準備します。
   2. 100グラムL.を計量clavatum胞子ほこりを作成せずに離れいかなる発火源から。
      注：ここで使用される胞子は、商業的に入手した（材料リストを参照してください）。
   3. ゆっくりと1Lのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、磁気攪拌棒を備えた丸底フラスコに移し胞子。
   4. 胞子に500ミリリットルのアセトンを追加します。PTFEフラスコと均質な懸濁液を形成するために軽くフラスコを振ります。
   5. 50℃に設定した水浴中にPTFEフラスコを置き、還流冷却器に接続します。
   6. 200rpmで攪拌しながら6時間アセトン中で還流を行い、その後、室温で冷却させます。
   7. 真空下、濾紙を用いて懸濁液を濾過し、大きな（直径15cm）をガラスペトリ皿に脱脂胞子を集めます。
   8. 溶媒を蒸発させるための穴をアルミホイルで覆うことにより、室温（ヒュームフード）で胞子を乾燥させます。
2. 酸分解
   1. 85％を準備し、脱イオンと（v / v）のリン酸（DI）水および1LのPTFEフラスコに脱脂乾燥胞子を転送します。
   2. 脱脂胞子にリン酸（85％v / vの）の500ミリリットルを追加します。
   3. 70℃に設定した水浴中にPTFEフラスコを置き、還流冷却器に接続します。
   4. 30時間リン酸中で穏やかな還流（70℃）を行い、その後に許可室温で冷却。
   5. 500 mlの温かい脱イオン水を使用して懸濁液を希釈し、濾紙を用いて真空ろ過によりSECSを集めます。
   6. 洗浄液のシリーズを実行するために3リットルのガラス製ビーカーにSECSを転送します。
3. SECの洗濯
   1. ヒュームフードにSECSを含む3 Lのガラスビーカーを置きます。
   2. 10分間穏やかに攪拌しながら秒に800ミリリットル熱い（50℃）DI水を追加します。
   3. ろ紙と真空濾過セットアップを使用してサスペンションをフィルタリングします。
   4. きれいな3LのガラスビーカーにSECSを収集します。
   5. 繰り返しは、1.3.1を繰り返します。 1.3.4。五回。
   6. 10分間穏やかに攪拌しながら秒に600ミリリットル熱い（45℃）のアセトンを追加します。
   7. 真空下で濾過によりSECSを収集し、クリーンな3リットルのガラス製ビーカーにSECSを転送します。
   8. 繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット600ミリリットル（50°C）、2 M塩酸を用いて。
   9. 繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホ600ミリリットルを使用して、T（50°C）、2 M水酸化ナトリウム。
   10. 繰り返しは、1.3.1と1.3.4を8回繰り返します。
   11. 繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット600ミリリットル（45℃）アセトンを使用。
   12. 繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット600ミリリットル（45°C）エタノールを使用。
   13. 繰り返しは、1.3.6を繰り返します。および1.3.7。ホット800ミリリットル（50°C）DI水を使用。
   14. すべての水分を除去するために、室温で24時間ドラフト内で6大きなガラスシャーレとドライにきれいなSECSを転送します。
   15. 60℃、10時間、または一定重量になるまで1ミリバールの真空の真空オーブン中で秒を乾燥させます。
   16. 乾燥したSECSを収集し、ポリプロピレンボトルに移します。
   17. 乾燥キャビネットにSECSを保管してください。

SECSの2キャラクタリゼーション

1. さまざまな段階で生産さ胞子とSECSを使用して、走査型電子顕微鏡分析^41を行います。
2. さまざまな段階で生産さ胞子とSECSを使用して元素分析^41を行います。 D元素分析の前に、少なくとも1時間60℃ですべてのサンプルRYと6.25の増倍率で％の窒素を使用して、タンパク質含有量を計算する^。11、各試料について三重の測定値を使用して結果を取得します。
3. 動画粒子分析器を使用してmicromeritic特性分析を行う^。41
4. 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、未処理のスキャン処理、及びFITC-BSA-ロードさ秒⁴¹

真空装填法による3.生体高分子カプセル化

1. DI水、50 mlのポリプロピレンチューブへの転送を使用して125 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）溶液1.2 mlで調製します。
2. SECS 150mgのを秤量し、BSA溶液に移します。
3. 均一な溶液を形成するために10分間チューブをボルテックス。
4. ろ紙を使用してチューブをカバーしています。
5. 1ミリバールの真空で4時間、凍結乾燥機フラスコや乾燥にチューブを転送します。
6. 手順3.1を実行します3.5。三つの独立したバッチのため。
7. BSA-ロードSECSを収集し、乳鉢と乳棒を使用して凝集物を除去します。
8. 50ミリリットルチューブにBSA-ロードされたSECSを移し、残留BSAを除去するために、2ミリリットルのDI水を追加します。
9. 5分間4704×gで遠心分離することによってSECSを収集し、上清を捨てます。
10. 一度DI水での洗浄を繰り返します。
11. ろ紙を用いてBSA-ロードSECSを含むチューブをカバーしています。
12. 冷凍庫（-20℃）にSECSを移し、1時間凍結します。
13. さらなる特性まで冷凍庫で24時間とストアのSECSを凍結乾燥します。
14. ステップ3.1と同様の手順を使用して、BSAを含まないプラセボSECSを準備します。 3.13に。
15. 3.1の手順と同様の手順を使用してFITC-BSAロードされたSECSを準備します。 3.13に。

カプセル化効率の4決意

1. 2ミリリットルポリプロピレンチューブ中のBSA-ロードされたSECS 5mgを秤量します。
2. 1.4ミリリットルホスファを追加TEは、5分間の生理食塩液pH7.4（PBS）と渦緩衝しました。
3. プローブは、10秒の3サイクルの間、40％の振幅でサスペンションを超音波処理します。
4. 0.45μmのポリエーテルスルホン（PES）フィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。
5. ステップ4.1と同様の手順を実行します。 4.4。プラセボSECSを使用。
6. ブランクとしてプラセボを用いて280nmでの吸光度を測定します。
7. BSAの量は、PBS中のBSA標準曲線（200〜1000μgの/ ml）を用いてカプセル化された定量化する^。42

結果

スポロポレニン外膜カプセルのための合理化された抽出処理

L. clavatum SEC抽出は、3つの主な工程によって達成された：（1）アセトンを用いて脱脂します。 （2）酸分解、リン酸を85％使用した（V / V）溶媒を用いて、（3）広範SEC洗浄。合理SEC抽出処理の流れは図1のAに示されている-私...

ディスカッション

この作品、L.からSEC抽出の体系的な分析ではclavatumの胞子を提示し、この報告書はまた、既存の一般的に使用されるプロトコルの重要な合理化を達成しつつ、より高品質のカプセルを製造することが可能であることを示している。高い処理温度（180°C）を必要とする既存のプロトコルとは対照的に¹¹と長いプロセス時間（7日^）、11現在のSEC抽出処理の最適化は、主...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220