Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione

Riepilogo

Questo protocollo / manoscritto descrive un processo semplificato per la produzione di capsule exine sporopollenin (sec) da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi SECs.

Abstract

Microcapsule derivati ​​da spore o pollini vegetali forniscono una solida piattaforma per una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione. capsule sporopollenin exine (sec) si ottengono quando spore o polline sono trattati in modo da rimuovere il contenuto sporoplasmic interne. Le microcapsule risultanti cave presentano un elevato grado di uniformità micromeritica e conservano intricate caratteristiche microstrutturali relative alle particolari specie vegetali. Qui, dimostriamo un processo semplificato per la produzione di secondi da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi sec. L'attuale procedura di isolamento SEC è stato recentemente ottimizzato per ridurre in modo significativo i requisiti di elaborazione che vengono convenzionalmente utilizzati in isolamento SEC, e per garantire la produzione di microcapsule intatti. L. naturale spore clavatum sono sgrassati con acetone, trattata con acido fosforico, e ampiamente lavati per rimuovere sporoplasmicontenuti c. Dopo l'acetone sgrassante, è stato dimostrato che una singola fase di lavorazione con acido fosforico 85% per rimuovere tutti i contenuti sporoplasmic. Limitando il tempo di elaborazione acido per 30 ore, è possibile isolare SEC pulite ed evitare SEC fratturazione, che ha dimostrato di verificarsi con tempo di lavorazione prolungato. lavaggio abbondante con acqua, acidi diluiti, diluire basi e solventi assicura che tutti i residui di materiale e chimiche sporoplasmic siano adeguatamente rimossi. La tecnica del vuoto di carico è utilizzata per caricare un modello proteine ​​(albumina sierica bovina) come composto idrofilico rappresentativo. Vacuum loading fornisce una tecnica semplice per caricare vari composti senza la necessità di solventi o sostanze chimiche aggressive indesiderabili che sono spesso richiesti in altri protocolli di microincapsulazione. Sulla base di questi protocolli di isolamento e di carico, SEC fornire un materiale promettente per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione, ad esempio, terapie, alimenti, cosmetici, e prod cura personaledotti.

Introduzione

C'è un notevole interesse in capsule a base di piante naturali ottenuti da spore di piante e pollini per l'uso in applicazioni di microincapsulazione. ^1-15 In natura, spore e polline forniscono protezione per i materiali genetici sensibili nei confronti di condizioni ambientali difficili. La struttura di base di spore vegetali e polline tipicamente comprende uno strato esterno shell (esina), uno strato guscio interno (intine), e il materiale citoplasmatico interna. Il exine comprende un biopolimero chimicamente robusta ^1,9,10,13,16 denominato sporopollenin e intine è composto principalmente da materiali cellulosici. ^16-18 capsule vuote possono essere isolati da vari processi ^7,9 per rimuovere il materiale citoplasmatico , proteine, e lo strato intine. ^2,12,16 Queste capsule exine sporopollenin (sec) forniscono una valida alternativa per incapsulanti sintetici a causa della loro distribuzione concentrata dimensioni e morfologia uniforme. ^7,9,13,19,20 ilsviluppo di processi standardizzati per ottenere secondi da varie specie vegetali, come Lycopodium clavatum, si apre la possibilità di una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione nei campi della somministrazione dei farmaci, alimenti e cosmetici. ^6,10-13,21

Per ottenere SECs, ricercatori prima trattati spore e polline con solventi organici e ricadere in soluzioni alcaline per rimuovere contenuti citoplasmatici. ^22-25 Tuttavia, la struttura della capsula rimanente è stato determinato per contenere ancora il livello intine cellulosico. Per eliminare questo, i ricercatori hanno esplorato l'uso di prolungato trattamento idrolisi acida con acido cloridrico, acido solforico caldo, o acido fosforico caldo per diversi giorni, ^22-25 con acido fosforico diventando il metodo preferito di rimozione intine SEC. ² Tuttavia, continua ricerca nel corso degli anni ha dimostrato che i vari spore e pollini hanno diversi gradi di resistenza al me elaborazione durathods comunemente usato. ^26,27 Alcune spore e pollini sono completamente degradati e perdono tutto integrità strutturale in soluzioni alcaline forti, o diventano pesantemente danneggiato in forti soluzioni acide. ¹⁶ La variabilità in risposta SEC a condizioni di trattamento è dovuta a lievi variazioni nella chimica struttura e la morfologia exine del materiale sporopollenin exine tra le specie. ²⁸ a causa della variabilità nella robustezza dei sporopollenin capsule exine (sec), è necessario ottimizzare le condizioni di elaborazione per ogni specie di spore e polline.

Spore pianta dal specie L. clavatum sono diventati la fonte singola più studiati della SEC. Si propone che questo è soprattutto a causa della sua ampia disponibilità, a basso costo, monodispersity, e la robustezza chimica ^9,29 Le spore possono essere facilmente raccolto e contiene contenuti sporoplasmic sotto forma di raggruppamenti di 1 -. 2 micron organelli cellulari e Biomolecules. ¹¹ L. spore clavatum sono stati utilizzati come lubrificante polvere naturale, ^30,31 base per cosmetici, ³⁰ e in erboristeria ^32-36 per un'ampia gamma di applicazioni terapeutiche. I SEC ottenuti da L. clavatum hanno dimostrato di essere più resistente al trattamento di secondi da altre specie di spore e polline. ² Dopo l'elaborazione, i SEC risultanti hanno dimostrato di mantenere le loro strutture microridge intricate e un'elevata uniformità morfologica, fornendo una grande cavità interna per l'incapsulamento. ⁷ Gli studi indicano che L. SEC clavatum possono essere utilizzati per l'incapsulamento dei farmaci, vaccini, ^{10,13 11} proteine, ^7,14 cellule, ⁸ oli, ^5-7,9 e integratori alimentari. ^5,15 osservati efficienza di carico SEC sono relativamente alti in confronto ai tradizionali incapsulamento materiali. ⁷ Non ci sono anche una serie di vantaggi segnalatiSEC incapsulamento come la capacità di mascherare gusti, ^6,10 e per fornire un certo grado di protezione naturale contro l'ossidazione. ¹² Negli studi esistenti, il metodo di estrazione più comunemente usato SEC per L. clavatum si basa su quattro fasi principali. Passo è riflusso del solvente in acetone per 12 ore a 50 ° C per sgrassare le spore. ¹¹ Fase due è riflusso alcalina in idrossido di potassio 6% fino a 12 ore a 120 ° C per rimuovere citoplasmatica e materiali proteici. ¹¹ Fase tre è riflusso acido in acido fosforico 85% fino a 7 giorni a 180 ° C per rimuovere il materiale intine cellulosiche. ¹¹ Fase quattro è un processo di lavaggio completo con acqua, solventi, acidi e basi per rimuovere materiale non exine restante e residui chimici.

Gli obiettivi principali di estrazione SEC in relazione alle applicazioni di incapsulamento sono per la produzione di capsule che sono vuoti di materiale citoplasmatica, gratis from proteine potenzialmente allergeniche, e morfologicamente intatto. ^2,37 Tuttavia, dal punto di vista della produzione industriale, è anche importante considerare fattori economici e ambientali, quali l'efficienza energetica, durata della produzione, la sicurezza, ei residui risultanti. Per quanto riguarda l'efficienza energetica, sia ad alte temperature e tempi di lavorazione lunghi incidono sui costi di produzione e impatto ambientale. la durata della produzione e tempi di risposta sono fattori chiave che influenzano l'elaborazione redditività. Di particolare interesse è che il trattamento acido fosforico alta temperatura aumenta i problemi di sicurezza ed è noto per causare incrostazioni corrosivo che porta a un aumento significativo nella manutenzione delle infrastrutture e ritardi nei tempi di consegna dei lotti. ^38-40 Ove possibile, riducendo al minimo il numero di passaggi necessari può portare per ridurre significativamente i rifiuti prodotti. Tuttavia, comunemente utilizzati quattro fasi di L. Estrazione clavatum SEC ha semplicemente evolved da decenni di ricerca e ha avuto poca ottimizzazione del processo vero e proprio. Recentemente, Mundargi et al., ⁴¹ ha fatto un significativo contributo ai lavori in corso in questo campo, valutando in modo sistematico e ottimizzando una delle tecniche di estrazione SEC più comunemente riportati.

Nella prima sezione di questo studio: spore sgrassamento è dimostrata utilizzando trasformazione acetone a 50 ° C per 6 ore; procedure sporoplasm e rimozione intine siano dimostrate utilizzando 85% trattamento acido fosforico a 70 ° C per 30 h; vasta lavaggio con acqua, solventi, acidi, e la base viene usata per dimostrare la rimozione del contenuto sporoplasmic residui; e SEC asciugatura è dimostrato utilizzando la convezione di essiccazione e il vuoto forno di essiccazione. Nella terza sezione, SEC vuoto carico è dimostrata utilizzando loading vuoto di una proteina modello, albumina di siero bovino (BSA), seguita da BSA-caricata-SEC lavaggio e liofilizzazione. Nella quarta sezione, la determinzione del rendimento incapsulamento BSA è dimostrata utilizzando centrifugazione, sonda sonicazione, e UV / Vis spettrometria.

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Protocollo

1. Estrazione di sporopollenin exine capsule (SEC) da L. clavatum spore

Nota: Il processo di estrazione SEC comporta una polvere infiammabile (L. clavatum), acidi corrosivi caldi, e solventi infiammabili, quindi un equipaggiamento di protezione individuale (occhiali, maschera viso, guanti, camice da laboratorio), la valutazione dei rischi approvato il loro utilizzo, e lo smaltimento dei prodotti chimici da personale di laboratorio autorizzato è essenziale.

1. spore sgrassante
   1. Preparare un reflusso set-up in una cappa aspirante tramite un condensatore di vetro, sistema di circolazione dell'acqua e bagnomaria (Figura 1).
   2. Pesare 100 g L. spore clavatum senza creare polvere e lontano da fonti di ignizione.
      Nota: Le spore utilizzate qui sono state commercialmente ottenuto (vedi Materiali List).
   3. spore Trasferire lentamente ad una 1 L politetrafluoroetilene (PTFE) pallone a fondo tondo con un agitatore magnetico.
   4. Aggiungere 500 ml di acetone per le spore delpallone PTFE e scuotere delicatamente il pallone in modo da formare una sospensione omogenea.
   5. Porre il pallone PTFE nel set bagnomaria a 50 ° C e connettersi al condensatore a riflusso.
   6. Eseguire riflusso in acetone per 6 ore con agitazione a 200 rpm e poi si lascia raffreddare a temperatura ambiente.
   7. Filtrare la sospensione con carta da filtro sotto vuoto e raccogliere le spore sgrassate in grandi (15 cm di diametro) piatti di vetro di Petri.
   8. Essiccare le spore a temperatura ambiente (cappa) coprendo con un foglio di alluminio con fori per evaporazione del solvente.
2. acidolisi
   1. Preparare 85% (v / v) di acido fosforico con acqua deionizzata (DI) e trasferire spore secco sgrassate in un matraccio PTFE 1 L.
   2. Aggiungere 500 ml di acido fosforico (85% v / v) alle spore sgrassate.
   3. Porre il pallone PTFE in un set bagno di acqua a 70 ° C e connettersi al condensatore a riflusso.
   4. Eseguire dolce riflusso (70 ° C) in acido fosforico per 30 ore e quindi si lascia araffreddare a temperatura ambiente.
   5. Diluire la sospensione con acqua DI 500 ml caldo e raccogliere i SEC per filtrazione sotto vuoto usando carta da filtro.
   6. Trasferire il SECs ad un bicchiere di vetro 3 L per eseguire una serie di lavaggi.
3. SEC lavaggio
   1. Posizionare il bicchiere di vetro 3 L contenente SEC in una cappa aspirante.
   2. Aggiungere (50 ° C) acqua deionizzata 800 ml caldo per le SEC con delicata agitazione per 10 minuti.
   3. Filtrare la sospensione utilizzando carta da filtro e filtrazione sottovuoto set-up.
   4. Raccogliere la SEC in un bicchiere di vetro pulito 3 L.
   5. Ripetere i punti 1.3.1. a 1.3.4. cinque volte.
   6. Aggiungere 600 ml a caldo (45 ° C) acetone per le SECs con blanda agitazione per 10 min.
   7. Raccogliere le sec in filtrazione sotto vuoto e trasferire i secondi per un bicchiere di vetro pulito 3 L.
   8. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (50 ° C) 2 M di acido cloridrico.
   9. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml Hot (50 ° C) 2 M di idrossido di sodio.
   10. Ripetere i punti 1.3.1 e 1.3.4 otto volte.
   11. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. usando 600 ml a caldo (45 ° C) di acetone.
   12. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (45 ° C) di etanolo.
   13. Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 800 ml a caldo (50 ° C) acqua deionizzata.
   14. Trasferire i SEC pulite a sei grandi piatti in vetro di Petri e secco in una cappa aspirante a temperatura ambiente per 24 ore per rimuovere tutti i contenuti di acqua.
   15. Essiccare le SECs in stufa da vuoto a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore o fino a peso costante.
   16. Raccogliere la SEC secca e trasferimento in una bottiglia in polipropilene.
   17. Conservare la SEC in un armadio asciutto.

2. Caratterizzazione di SEC

1. Eseguire elettronico a scansione analisi microscopica ⁴¹ con spore e SEC prodotte in diverse fasi.
2. Effettuare analisi elementare ⁴¹ con spore e SEC prodotte in diverse fasi. Dry tutti i campioni a 60 ° C per almeno 1 ora prima analisi elementare e calcolare il contenuto proteico con azoto per cento, con un fattore di moltiplicazione di 6,25. ¹¹ ottenere risultati utilizzando misurazioni triplicato per ogni campione.
3. Condurre micromeritica analisi proprietà utilizzando un analizzatore di immagini di particelle dinamica. ⁴¹
4. Scansione non trasformati, elaborati e SEC FITC-BSA-caricati usando la microscopia confocale a scansione laser. ⁴¹

3. Biomacromolecule incapsulamento da vuoto Tecnica Caricamento

1. Preparare 1,2 ml di 125 mg / ml soluzione albumina sierica bovina (BSA) usando acqua deionizzata e trasferire in una provetta di polipropilene da 50 ml.
2. Pesare 150 mg di SEC e trasferire alla soluzione BSA.
3. Agitare la provetta per 10 minuti per formare una soluzione omogenea.
4. Coprire il tubo con carta da filtro.
5. Trasferire il tubo in un pallone liofilizzatore e asciugare per 4 ore con vuoto a 1 mbar.
6. Eseguire i passaggi 3.1a 3,5. per tre lotti indipendenti.
7. Raccogliere il SECs BSA-caricati e rimuovere gli agglomerati utilizzando un mortaio e pestello.
8. Trasferire i SEC BSA-caricati ad un tubo da 50 ml e aggiungere acqua DI 2 ml per rimuovere il residuo di BSA.
9. Raccogliere le SEC per centrifugazione a 4.704 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.
10. Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata una volta.
11. Coprire il tubo contenente SEC BSA-caricati con carta da filtro.
12. Trasferire i secondi per un congelatore (-20 ° C) e congelare per 1 ora.
13. Congelare asciugare la SEC per 24 ore e conservare in un congelatore fino ulteriore caratterizzazione.
14. Preparare i SEC placebo senza BSA utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13.
15. Preparare i FITC-BSA SEC caricati utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13.

4. Determinazione del incapsulamento efficienza

1. Pesare 5 mg di BSA SEC-caricati in 2 ml di tubi di polipropilene.
2. Aggiungere 1,4 ml phosphaTE soluzione salina tamponata a pH 7,4 (PBS) e vortex per 5 min.
3. Probe Sonicare la sospensione a 40% dell'ampiezza per 3 cicli di 10 sec.
4. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,45 micron Polietersulfone (PES).
5. Eseguire la stessa procedura descritta nella passi 4.1. a 4.4. utilizzando SEC placebo.
6. Misurare l'assorbanza a 280 nm con placebo, come uno spazio vuoto.
7. Quantificare la quantità di BSA incapsulato utilizzando una curva standard BSA (200 a 1.000 mg / ml) in PBS. ⁴²

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Risultati

Processo di estrazione semplificata per sporopollenin exine Capsule

La L. Estrazione clavatum SEC è stato raggiunto da tre fasi principali: (1) Sgrassante con acetone; (2) acidolisi con acido fosforico 85% (v / v); e (3) Ampia SEC lavaggio con solventi. Il flusso del processo di estrazione SEC aerodinamico è presentato in Figura 1 A -. I Brevemente, il processo comporta una...

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Discussione

In questo lavoro, un'analisi sistematica di estrazione SEC da L. spore clavatum viene presentato e questo rapporto mostra che è possibile produrre capsule di qualità superiore ottenendo anche una semplificazione significativa del preesistente protocollo comunemente utilizzato. ¹¹ Contrariamente al protocollo esistente che richiede una temperatura elevata processo (180 ° C) e durata lungo processo (7 giorni), ¹¹ all'ottimizzazione trasformazione di estrazione corrente SE...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220