Capsules à base de plantes Extraction de microencapsulation pour Applications

Résumé

Ce protocole / manuscrit décrit un processus simplifié pour la production de capsules de exine sporopollenine (articles) de Lycopodium spores de clavatum et pour le chargement de composés hydrophiles dans ces SECs.

Résumé

Les microcapsules provenant de spores ou de pollen à base de plantes fournissent une plate-forme robuste pour une large gamme d'applications de microencapsulation. capsules sporopollenine de exine (SECS) sont obtenus lorsque les spores ou le pollen sont traitées de manière à supprimer le contenu sporoplasmic internes. Les microcapsules creuses résultantes présentent un degré élevé d'uniformité microméritiques et conservent leurs caractéristiques microstructurales complexes liées aux espèces végétales particulières. Ici, nous démontrons un processus simplifié pour la production de SECs de Lycopodium spores de clavatum et pour le chargement de composés hydrophiles dans ces SECs. La procédure actuelle d'isolement SEC a récemment été optimisée afin de réduire de manière significative les exigences de traitement qui sont classiquement utilisés dans l'isolement de la SEC, et d'assurer la production de microcapsules intactes. Natural L. Les spores de clavatum sont dégraissés avec de l' acétone, traitée avec de l' acide phosphorique, et largement lavés pour éliminer sporoplasmicontenu c. Après l'acétone dégraissement, une étape de traitement unique en utilisant 85% d'acide phosphorique a été montré pour supprimer tous les contenus sporoplasmic. En limitant le temps de traitement acide à 30 h, il est possible d'isoler SECs propre et d'éviter la SEC fracturation, qui a été montré pour se produire avec le temps de traitement prolongé. lavage extensif avec de l'eau, les acides dilués, diluer les bases et les solvants assure que tous les résidus de matières chimiques et sporoplasmic sont suffisamment supprimés. La technique de chargement à vide est utilisé pour charger une protéine modèle (sérumalbumine bovine) comme composé hydrophile représentative. Vacuum chargement fournit une technique simple pour charger divers composés sans avoir besoin de solvants agressifs ou des produits chimiques indésirables qui sont souvent nécessaires dans d'autres protocoles de microencapsulation. Sur la base de ces protocoles d'isolement et de chargement, SECs fournir un matériau prometteur pour une utilisation dans un large éventail d'applications de microencapsulation, tels que, la thérapeutique, les aliments, les produits cosmétiques et de soins personnels produits.

Introduction

Il y a beaucoup d' intérêt dans des capsules à base de plantes naturelles obtenues à partir de spores de plantes et les pollens pour une utilisation dans les applications de microencapsulation ^1-15 Dans la nature., Les spores et le pollen assurent la protection des matériaux génétiques sensibles contre les conditions environnementales difficiles. La structure de base de spores de plantes et de pollen comprend typiquement une couche externe de l'enveloppe (en exine), une couche d'enveloppe intérieure (intine) et le matériau cytoplasmique interne. L'exine est composé d'un biopolymère chimiquement robuste ^1,9,10,13,16 dénommé sporopollénine et la intine est composée essentiellement de matériaux cellulosiques. ^16-18 capsules vides peuvent être isolés par divers procédés ^7,9 pour éliminer le matériau cytoplasmique , des protéines, et la couche de intine. ^2,12,16 Ces capsules de exine sporopollenine (SECs) fournissent une alternative convaincante aux encapsulants synthétiques en raison de leur distribution de taille étroite et la morphologie uniforme. ^7,9,13,19,20 ladéveloppement de procédés standardisés pour obtenir SECs de diverses espèces végétales, telles que Lycopodium clavatum, ouvre la possibilité d'une large gamme d'applications de microencapsulation dans les domaines de la délivrance de médicaments, les aliments et les cosmétiques ^6,10-13,21.

Afin d'obtenir SECs, les chercheurs ont d' abord été traitées avec des spores et le pollen des solvants organiques et chauffé au reflux dans des solutions alcalines pour éliminer les matières cytoplasmiques. ^22-25 Cependant, la structure de la capsule restante a été déterminée à contenir encore la couche intine cellulosique. Afin d'éliminer cela, les chercheurs ont exploré l'utilisation de longue traitement d'hydrolyse acide avec de l' acide chlorhydrique, l' acide sulfurique chaud, ou de l' acide phosphorique chaud pendant plusieurs jours, ^22-25 avec de l' acide phosphorique de devenir la méthode préférée de intine élimination SEC. ² Toutefois, en cours la recherche au cours des années a montré que diverses spores et pollens ont des degrés de résistance différents à la me traitement durethodes couramment utilisé. ^26,27 Quelques spores et les pollens sont complètement dégradés et perdent toute intégrité structurelle dans les solutions alcalines fortes, ou deviennent fortement endommagés dans des solutions acides forts. ¹⁶ La variabilité de la réponse SEC à des conditions de traitement est due à des variations subtiles dans le produit chimique exine structure et la morphologie du matériau de sporopollenine exine entre les espèces. ²⁸ en raison de la variabilité de la robustesse des capsules de exine sporopollenine (articles), il est nécessaire d'optimiser les conditions de traitement pour chaque espèce de spores et le pollen.

Les spores de plantes de l'espèce L. clavatum sont devenus la source unique la plus largement étudiée de SECs. Il est proposé que cela est principalement dû à sa grande disponibilité, à faible coût, monodispersité et robustesse chimique ^9,29 Les spores peuvent être facilement récoltées et contient le contenu sporoplasmic sous la forme de groupements de 1 -. 2 um organites cellulaires et biomolecules. ¹¹ L. Les spores clavatum ont été utilisés comme lubrifiant de poudre naturelle, une base ^30,31 pour les produits cosmétiques, ³⁰ et ^32-36 en phytothérapie pour une large gamme d'applications thérapeutiques. Les SECs obtenus à partir de L. clavatum ont été montré pour être plus résistante au traitement que SECs d'autres espèces de spores et le pollen. ² Après le traitement, les SECs résultant ont été montré pour conserver leurs structures de microridge complexes et l' uniformité morphologique , tout en offrant une grande cavité interne pour l' encapsulation. ⁷ Des études indiquent que L. SECs clavatum peuvent être utilisés pour l'encapsulation des médicaments, des vaccins, des ^{10,13 11} protéines, ^7,14 cellules, ⁸ huiles, ^5-7,9 et compléments alimentaires. ^5,15 observés efficacité de chargement de la SEC sont relativement élevés par rapport aux classiques encapsulation des matériaux. ⁷ Il existe également un certain nombre d'avantages signalésà SEC encapsulation telles que la capacité de masquer les goûts, ^6,10 et de fournir un certain degré de protection naturelle contre l' oxydation. ¹² Dans les études existantes, SEC la méthode la plus couramment utilisée pour l' extraction L. clavatum est basé sur quatre étapes principales. La première étape consiste à reflux de solvant dans l' acétone pendant jusqu'à 12 heures à 50 ° C pour dégraisser les spores. ¹¹ La deuxième étape est le reflux alcalin dans 6% d' hydroxyde de potassium pendant jusqu'à 12 heures à 120 ° C pour éliminer cytoplasmique et les matières protéiniques. ¹¹ Etape trois est reflux acide dans 85% d' acide phosphorique jusqu'à 7 jours à 180 ° C pour éliminer le matériau de intine cellulosique. ¹¹ la quatrième étape est un processus de lavage complet en utilisant l' eau, les solvants, les acides et les bases pour éliminer tout le reste du matériel non exine et les résidus chimiques.

Les principaux objectifs de l'extraction SEC par rapport aux applications d'encapsulation sont de produire des capsules qui sont vides de matériau cytoplasmique, libre from protéines potentiellement allergènes, et morphologiquement intacts. ^2,37 Cependant, du point de vue de la fabrication industrielle, il est également important de tenir compte de facteurs économiques et environnementaux supplémentaires, tels que l' efficacité énergétique, la durée de la production, la sécurité, et les déchets résultant. En ce qui concerne l'efficacité énergétique, des températures élevées et des longs délais de traitement influent sur les coûts de production ainsi que l'empreinte environnementale. la durée de la production et le délai d'exécution sont des facteurs clés qui influent sur la rentabilité de traitement. Il est particulièrement préoccupant que le traitement de l' acide phosphorique à haute température augmente les problèmes de sécurité et est connu pour entraîner l'entartrage corrosif qui conduit à des augmentations significatives de la maintenance des infrastructures et des retards dans les délais de traitement par lots ^38-40. Lorsque cela est possible, ce qui réduit le nombre d'étapes nécessaires peut conduire à réduire de manière significative les déchets produits. Cependant, le couramment utilisé en quatre étapes de L. extraction clavatum SEC a simplement evolved de décennies de recherche et a eu peu d'optimisation de processus réel. Récemment, Mundargi et al., ⁴¹ a apporté une contribution importante aux travaux en cours dans ce domaine par une évaluation systématique et d' optimiser l' une des techniques d'extraction de la SEC les plus fréquemment rapportés.

Dans la première partie de cette étude: spore dégraissement est démontrée en utilisant le traitement de l'acétone à 50 ° C pendant 6 heures; procédures de sporoplasme et d'enlèvement intine sont démontrées en utilisant 85% de traitement d'acide phosphorique à 70 ° C pendant 30 heures; lavage extensif avec de l'eau, les solvants, l'acide, et la base est utilisé pour démontrer l'élimination des matières résiduelles sporoplasmic; et le séchage SEC est démontrée utilisait le séchage par convection et séchage sous vide four. Dans la troisième section, SEC vide chargement est démontrée utilisait le chargement à vide d'une protéine modèle, l'albumine de sérum bovin (BSA), suivi par BSA-chargé-SEC lavage et lyophilisation. Dans la quatrième section, la détermintion de l'efficacité d'encapsulation est démontrée BSA utilisait une centrifugation, d'une sonde ultrasons, et UV Vis spectrométrie /.

Protocole

1. Extraction de sporopollenine Exine Capsules (SECs) de L. clavatum spores

Remarque: Le processus d'extraction SEC implique une poudre inflammable (L. clavatum), acides corrosifs chauds, et des solvants inflammables, l' équipement donc approprié de protection individuelle (lunettes, masque, gants, blouse de laboratoire), l' évaluation des risques approuvée sur l' utilisation et l' élimination des produits chimiques par le personnel de laboratoire autorisé est essentiel.

1. Spore dégraisse
   1. Préparer un reflux set-up dans une hotte en utilisant un condenseur en verre, système de circulation d'eau, et le bain d'eau (Figure 1).
   2. Peser 100 g L. spores clavatum sans créer de poussière et loin de toute source d'ignition.
      Remarque: Les spores utilisées ici ont été obtenus dans le commerce (voir la liste des matériaux).
   3. spores lentement à une 1 L polytétrafluoroéthylène (PTFE) ballon à fond rond avec une tige d'agitation magnétique de transfert.
   4. Ajouter 500 ml d'acétone aux spores dans leflacon de PTFE et agiter le flacon doucement pour former une suspension homogène.
   5. Placer le ballon de PTFE dans l'ensemble du bain d'eau à 50 ° C et se connecter au condenseur à reflux.
   6. Effectuer le reflux dans de l'acétone pendant 6 heures sous agitation à 200 tours par minute, puis laisser refroidir à température ambiante.
   7. Filtrer la suspension en utilisant du papier filtre sous vide et de recueillir les spores dégraissées dans les grandes (15 cm de diamètre) des boîtes de Pétri en verre.
   8. Sécher les spores à la température ambiante (hotte) en couvrant avec une feuille d'aluminium avec des trous pour l'évaporation du solvant.
2. acidolyse
   1. Préparer 85% (v / v) d'acide phosphorique avec désionisée (DI) et le transfert de spores sèches dégraissées à un 1 L PTFE flacon.
   2. Ajouter 500 ml d'acide phosphorique (85% v / v) pour les spores dégraissées.
   3. Placer le ballon de PTFE dans un ensemble de bain d'eau à 70 ° C et se connecter au condenseur à reflux.
   4. Effectuer doux reflux (70 ° C) dans l'acide phosphorique pendant 30 heures, puis laisserrefroidir à température ambiante.
   5. Diluer la suspension à l'aide de l'eau DI 500 ml au chaud et de recueillir les SECs par filtration sous vide en utilisant un papier filtre.
   6. Transférer le SECs à un 3 bêcher de verre pour effectuer une série de lavages.
3. SEC laver
   1. Placer le 3 L bêcher en verre contenant SECs dans une hotte.
   2. Ajouter (50 ° C) Eau DI 800 ml chaud aux SECs en agitant doucement pendant 10 min.
   3. Filtrer la suspension à l'aide d'un papier filtre et d'une filtration sous vide mis en place.
   4. Recueillir le SECs dans un endroit propre 3 L bêcher en verre.
   5. Répétez les étapes 1.3.1. à 1.3.4. cinq fois.
   6. Ajouter 600 ml à chaud (45 ° C) l'acétone aux SECs en agitant doucement pendant 10 min.
   7. Recueillir les SECs par filtration sous vide et transférer les SECs à un nettoyage de 3 L bêcher en verre.
   8. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml à chaud (50 ° C) d'acide chlorhydrique à 2 M.
   9. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml d'hot (50 ° C), 2 M d'hydroxyde de sodium.
   10. Répétez les étapes 1.3.1 et 1.3.4 huit fois.
   11. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml à chaud (45 ° C) d'acétone.
   12. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 600 ml à chaud (45 ° C), de l'éthanol.
   13. Répétez les étapes 1.3.6. et 1.3.7. en utilisant 800 ml chaud (50 ° C) de l'eau DI.
   14. Transférer les SECs propres à six grandes boîtes de Pétri en verre et sec dans une hotte à température ambiante pendant 24 heures pour éliminer tout le contenu de l'eau.
   15. Sécher les SECs dans une étuve sous vide à 60 ° C et 1 mbar, sous vide pendant 10 h ou jusqu'à poids constant.
   16. Recueillir le SECs séché et transférer à une bouteille en polypropylène.
   17. Stocker le SECs dans une armoire sèche.

2. Caractérisation des SECs

1. Effectuer électronique à balayage analyse microscopique ⁴¹ en utilisant des spores et SECs produites à différents stades.
2. Effectuer l' analyse élémentaire ⁴¹ en utilisant des spores et SECs produites à différents stades. réry tous les échantillons à 60 ° C pendant au moins 1 h avant l' analyse élémentaire et calculer la teneur en protéines en utilisant pour cent d' azote avec un facteur de multiplication de 6,25. ¹¹ Obtenir des résultats en utilisant des mesures en triple pour chaque échantillon.
3. Effectuer microméritiques analyse des propriétés à l' aide d' un analyseur d' image dynamique des particules. ⁴¹
4. Numérisation non traité, traité et SECs FITC-BSA-chargés en utilisant la microscopie à balayage laser confocal. ⁴¹

3. biomacromolécule Encapsulation par Vacuum Chargement Technique

1. Préparer 1,2 ml de 125 mg / ml de solution d'albumine de sérum bovin (BSA) en utilisant de l'eau déminéralisée et transférer dans un tube de polypropylene de 50 ml.
2. Peser 150 mg de SECs et transfert à la solution BSA.
3. Vortexer le tube pendant 10 minutes pour former une solution homogène.
4. Couvrir le tube en utilisant du papier filtre.
5. Transférer le tube dans un ballon à lyophilisateur et sécher pendant 4 h sous vide à 1 mbar.
6. Effectuer les étapes 3.1à 3,5. pour les trois lots indépendants.
7. Recueillir le SECs BSA-chargé et éliminer les agglomérats en utilisant un mortier et un pilon.
8. Transférer les SECs BSA-chargés dans un tube de 50 ml et ajouter 2 ml d'eau DI pour éliminer le BSA résiduel.
9. Recueillir les SECs par centrifugation à 4704 xg pendant 5 minutes et jeter le surnageant.
10. Répétez le lavage à l'eau DI fois.
11. Couvrir le tube contenant SECs BSA-chargés à l'aide de papier filtre.
12. Transférer les SECs dans un congélateur (-20 ° C) et congeler pendant 1 heure.
13. Lyophiliser la SECs pendant 24 heures et à stocker dans un congélateur jusqu'à une caractérisation plus poussée.
14. Préparer les SECs placebo sans BSA en utilisant la même procédure que dans les étapes 3.1. à 3.13.
15. Préparer les FITC-BSA SECs chargés en utilisant la même procédure que dans les étapes 3.1. à 3.13.

4. Détermination de l'efficacité Encapsulation

1. Peser 5 mg de SECs BSA-chargés dans 2 ml tubes en polypropylène.
2. Ajouter 1,4 ml phosphate une solution saline tamponnée à pH 7,4 (PBS) et au vortex pendant 5 min.
3. Probe Soniquer la suspension à 40% d'amplitude pendant 3 cycles de 10 sec.
4. Filtrer la solution à l'aide d'un 0,45 um Polyéthersulfone (PES) filtre.
5. Effectuez la même procédure que dans les étapes 4.1. à 4,4. utilisant SECs placebo.
6. Mesurer l'absorbance à 280 nm en utilisant un placebo comme un blanc.
7. Quantifier la quantité de BSA encapsulé à l' aide d' une courbe standard de la BSA (200 à 1000 pg / ml) dans du PBS. ⁴²

Résultats

Processus d'extraction fuselée pour sporopollenine exine Capsules

L. extraction clavatum SEC a été réalisée par trois étapes principales: (1) Dégraisse utilisant de l' acétone; (2) acidolyse à l'aide d'acide phosphorique à 85% (v / v); et (3) un lavage extensif SEC en utilisant des solvants. Le flux du processus d'extraction SEC simplifiée est présentée à la ...

Discussion

Dans ce travail, une analyse systématique de l' extraction SEC de L. Les spores de clavatum est présenté et ce rapport montre qu'il est possible de produire des capsules de qualité supérieure tout en réalisant une importante rationalisation du protocole couramment utilisé pré-existant. ¹¹ Contrairement au protocole existant nécessitant une température élevée de processus (180 ° C) et une longue durée de traitement (7 jours), ¹¹ l' optimisation de la SEC c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220