Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

Resumen

Este protocolo / manuscrito describe un proceso simplificado para la producción de cápsulas exina sporopollenin (segundos) de las esporas de Lycopodium clavatum y para la carga de compuestos hidrófilos en estos SEC.

Resumen

Las microcápsulas derivadas de esporas o polen de origen vegetal proporcionan una plataforma sólida para una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación. cápsulas sporopollenin exina (segundos) se obtienen cuando las esporas o polen son procesadas a fin de eliminar el contenido sporoplasmic internos. Las microcápsulas huecas resultantes exhiben un alto grado de uniformidad micromeritic y conservan características microestructurales intrincados relacionados con las especies de plantas particulares. En este documento, se demuestra un proceso simplificado para la producción de los CEE a partir de esporas clavatum Lycopodium y para la carga de compuestos hidrófilos en estos SEC. El procedimiento actual aislamiento SEC ha sido optimizado recientemente para reducir significativamente los requisitos de transformación que se usan convencionalmente en el aislamiento de la SEC, y para asegurar la producción de microcápsulas intactas. L. Natural esporas clavatum se desgrasados con acetona, se trató con ácido fosfórico, y extensamente lavadas para eliminar sporoplasmicontenido c. Después de desgrase acetona, un solo paso de procesamiento utilizando ácido fosfórico al 85% se ha demostrado para eliminar todos los contenidos sporoplasmic. Al limitar el tiempo de procesamiento de ácido a 30 hr, es posible aislar SEC limpias y evitar SEC fracturación, que se ha demostrado que se producen con el tiempo de procesamiento prolongado. Lavado extensivo con agua, ácidos diluidos, diluir bases, y disolventes asegura que todos los residuos de material y químicas sporoplasmic se eliminan adecuadamente. La técnica de carga de vacío se utiliza para cargar una proteína modelo (albúmina de suero bovino) como un compuesto hidrófilo representante. carga de vacío proporciona una técnica sencilla para cargar varios compuestos sin la necesidad de disolventes agresivos o productos químicos indeseables que a menudo se requieren en otros protocolos de microencapsulación. Sobre la base de estos protocolos de aislamiento y de carga, SEC proporcionar un material prometedor para su uso en una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación, como por ejemplo, terapéutica, alimentos, cosméticos, cuidado personal y prodductos.

Introducción

Existe un interés significativo en cápsulas a base de plantas naturales obtenidos a partir de las esporas y el polen de las plantas para uso en aplicaciones de microencapsulación. ^1-15 En la naturaleza, las esporas y el polen proporcionan protección para materiales genéticos sensibles contra condiciones ambientales duras. La estructura básica de las esporas de plantas y polen comprende típicamente una capa externa shell (exina), una capa envolvente interior (intine), y el material citoplásmica interna. La exina se compone de una químicamente robusto biopolímero ^1,9,10,13,16 referido como sporopollenin y de la intine se compone principalmente de materiales celulósicos. ^16-18 cápsulas vacías se pueden aislar mediante diversos procesos de ^7,9 para la eliminación de material citoplásmico , proteínas, y la capa intine. ^2,12,16 Estas cápsulas exina sporopollenin (SEC) proporcionan una alternativa atractiva a los encapsulantes sintéticas debido a su estrecha distribución de tamaño y morfología uniforme. ^7,9,13,19,20 eldesarrollo de procesos estandarizados para obtener SEC de diversas especies de plantas, tales como Lycopodium clavatum, se abre la posibilidad de una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación en los campos de la administración de fármacos, alimentos y cosméticos. ^6,10-13,21

Con el fin de obtener SEC, los investigadores trataron primero esporas y el polen con disolventes orgánicos y calentó a reflujo en soluciones alcalinas para eliminar contenido citoplásmico. ^22-25 Sin embargo, se determinó la estructura de cápsula restante todavía contienen la capa intine celulósico. Para eliminar esto, los investigadores exploraron el uso del procesamiento de la hidrólisis ácida prolongado con ácido clorhídrico, ácido sulfúrico caliente, o ácido fosfórico caliente durante varios días, ^22-25 con ácido fosfórico convertirse en el método preferido de eliminación intine SEC. ² Sin embargo, en curso la investigación en los últimos años ha demostrado que varias esporas y pólenes tienen diferentes grados de firmeza frente a la dura conmigo procesamientothods comúnmente utilizado. ^26,27 Algunas esporas y el polen son completamente degradados y pierden toda la integridad estructural en soluciones alcalinas fuertes, o se vuelven fuertemente dañado de fuertes soluciones ácidas. ¹⁶ La variabilidad en la respuesta a SEC condiciones de tratamiento es debido a las variaciones sutiles en el producto químico la estructura y la morfología del material exina sporopollenin exina entre las especies. ²⁸ Debido a la variabilidad en la robustez de cápsulas exina sporopollenin (segundos), es necesario optimizar las condiciones de transformación para cada especie de esporas y el polen.

Esporas de plantas de la especie L. Clavatum se han convertido en la fuente más ampliamente estudiado de la SEC. Se propone que esto es principalmente debido a su amplia disponibilidad, bajo coste, monodispersividad, química y robustez ^9,29 Las esporas pueden ser fácilmente cosechada y contiene contenidos sporoplasmic en forma de agrupaciones de 1 -. 2 micras orgánulos celulares y biomolecules. ¹¹ L. esporas clavatum se han utilizado como un lubricante en polvo natural, ^30,31 una base para cosméticos, ³⁰ y ^{32 a 36} en la medicina herbal para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas. Las SEC obtenidos de L. clavatum han demostrado ser más resistentes al procesamiento de SEC de otras especies de esporas y el polen. ² Después del procesamiento, las SEC resultantes se han demostrado para conservar sus estructuras microridge intrincados y alta uniformidad morfológica mientras que proporciona una gran cavidad interna para la encapsulación. ⁷ Los estudios indican que L. SEC clavatum se pueden utilizar para la encapsulación de medicamentos, vacunas, ^{10,13 11} proteínas, células, ^{7,14 8} aceites, ^5-7,9 y suplementos alimenticios. ^5,15 observados eficiencias de carga de la SEC son relativamente altos en comparación con los convencionales encapsulación de materiales. ⁷ también hay una serie de beneficios reportadosa SEC encapsulación tales como la capacidad de enmascarar sabores, ^6,10 y para proporcionar algún grado de protección natural contra la oxidación. ¹² En los estudios existentes, el método de extracción más utilizada SEC para L. Clavatum se basa en cuatro pasos principales. El primer paso es de reflujo del disolvente en acetona durante un máximo de 12 horas a 50 ° C para desecar las esporas. ¹¹ El segundo paso es el reflujo alcalino en hidróxido de potasio al 6% para un máximo de 12 horas a 120 ° C para eliminar citoplasmática y materiales proteicos. ¹¹ Paso tres es el reflujo ácido en ácido fosfórico al 85% durante un máximo de 7 días a 180 ° C para eliminar el material intine celulósico. ¹¹ el cuarto paso es un proceso exhaustivo lavado usando agua, disolventes, ácidos y bases para eliminar todo el material no exina restante y residuos químicos.

Los principales objetivos de la extracción de la SEC en relación con las aplicaciones de encapsulación son para producir cápsulas que están vacías de material citoplasmático, libre de aquí para alláproteínas M potencialmente alergénicos, y morfológicamente intactos. ^2,37 Sin embargo, desde una perspectiva de fabricación industrial, también es importante tener en cuenta factores económicos y ambientales adicionales, tales como, la eficiencia energética, la duración de producción, seguridad, y los residuos resultantes. Con respecto a la eficiencia energética, tanto en altas temperaturas y largos tiempos de procesamiento afectan a los costes de producción, así como el impacto medioambiental. duración de la producción y el tiempo de respuesta son factores clave que influyen en la rentabilidad de procesamiento. De particular preocupación es que el procesamiento de ácido fosfórico de alta temperatura aumenta los problemas de seguridad y es conocido por producir incrustaciones corrosivo que conduce a un aumento significativo en el mantenimiento de infraestructuras y los retrasos en los tiempos de respuesta por lotes. ^38-40 Siempre que sea posible, reduciendo al mínimo el número de pasos necesarios puede conducir a reducir significativamente los residuos producidos. Sin embargo, el comúnmente utilizado proceso de cuatro pasos de L. extracción Clavatum SEC tiene simplemente evolved de décadas de investigación y ha tenido poco optimización del proceso real. Recientemente, Mundargi et al., ⁴¹ hizo una importante contribución a la labor en curso en este campo mediante la evaluación y optimización de una de las técnicas de extracción de la SEC con mayor frecuencia de forma sistemática.

En la primera sección de este estudio: pérdida de grasa de esporas se demuestra la utilización de procesamiento de acetona a 50 ° C durante 6 horas; procedimientos esporoplasma y de eliminación de intine se demuestran la utilización de procesamiento de ácido fosfórico 85% a 70 ° C durante 30 h; extenso lavado con agua, disolventes, ácido y la base se utiliza para demostrar la eliminación de contenidos sporoplasmic residuales; y SEC secado se demuestra utilizando secado por convección y secado en horno de vacío. En la tercera sección, SEC carga de vacío se demuestra utilizando la carga de vacío de una proteína modelo, la albúmina de suero bovino (BSA), seguido de BSA-carga-SEC lavado y liofilización. En la cuarta sección, el deteración de la eficiencia de encapsulación de BSA se demuestra utilizando la centrifugación, la sonda de ultrasonidos, rayos UV y Vis / espectrometría.

Protocolo

1. Extracción de sporopollenin exina Cápsulas (SEC) de L. Las esporas clavatum

Nota: El proceso de extracción SEC implica un polvo inflamable (L. Clavatum), ácidos corrosivos calientes y disolventes inflamables, por lo tanto, el equipo de protección personal adecuado (gafas, mascarilla, guantes, bata de laboratorio), la evaluación de riesgos aprobado el uso y disposición de productos químicos autorizados por el personal de laboratorio es esencial.

1. Spore Desengrasante
   1. Preparar un reflujo configuración en una campana de extracción mediante el uso de un condensador de vidrio, sistema de circulación de agua, y baño de agua (Figura 1).
   2. Pesar 100 g L. esporas clavatum sin crear polvo y alejado de cualquier fuente de ignición.
      Nota: Las esporas usadas aquí fueron obtenidos comercialmente (Ver Lista de Materiales).
   3. esporas de transferencia lentamente a una politetrafluoroetileno 1 L (PTFE) matraz de fondo redondo con una varilla de agitación magnética.
   4. Añadir 500 ml de acetona a las esporas en elmatraz de PTFE y agitarlo suavemente para formar una suspensión homogénea.
   5. Colocar el matraz de PTFE en el conjunto de baño de agua a 50 ° C y conectar con el condensador de reflujo.
   6. Realizar reflujo en acetona durante 6 horas con agitación a 200 rpm y luego se deja enfriar a temperatura ambiente.
   7. Se filtró la suspensión utilizando un papel de filtro al vacío y recoger las esporas desgrasadas en grandes placas de Petri de vidrio (15 cm de diámetro).
   8. Se secan las esporas a temperatura ambiente (campana de humos), cubriendo con papel de aluminio con orificios para la evaporación del disolvente.
2. acidolysis
   1. Preparar 85% (v / v) de ácido fosfórico con agua desionizada (DI) y la transferencia de esporas secas desgrasados ​​a un matraz PTFE 1 L.
   2. Añadir 500 ml de ácido fosfórico (85% v / v) a las esporas desgrasados.
   3. Colocar el matraz en un conjunto de PTFE baño de agua a 70 ° C y conectar con el condensador de reflujo.
   4. Realizar suave reflujo (70 ° C) en ácido fosfórico durante 30 horas y se dejafresco a temperatura ambiente.
   5. Diluir la suspensión mediante el uso de agua DI 500 ml cálido y recoger las SEC por filtración al vacío utilizando papel de filtro.
   6. La transferencia de la SEC a un vaso de precipitados de vidrio de 3 l para realizar una serie de lavados.
3. Lavado SEC
   1. Poner el vaso de vidrio de 3 l que contenía los CEE en una campana de humos.
   2. Añadir (50 ° C) agua DI 800 ml caliente a las SEC con agitación suave durante 10 minutos.
   3. Se filtra la suspensión mediante el uso de papel de filtro y una filtración al vacío puesta a punto.
   4. Recoger la SEC en un vaso de vidrio limpio de 3 litros.
   5. Repita los pasos 1.3.1. a 1.3.4. cinco veces.
   6. Añadir 600 ml de acetona caliente (45 ° C) para las SEC con agitación suave durante 10 minutos.
   7. Recoger las SEC por filtración en vacío y transferir los segundos para una limpieza vaso de vidrio de 3 l.
   8. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml calientes (50 ° C) de ácido clorhídrico 2 M.
   9. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml hot (50 ° C) de hidróxido de sodio 2 M.
   10. Repita los pasos 1.3.1 y 1.3.4 de ocho veces.
   11. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml calientes (45 ° C) de acetona.
   12. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 600 ml calientes (45 ° C) de etanol.
   13. Repita los pasos 1.3.6. y 1.3.7. utilizando 800 ml calientes (50 ° C) de agua DI.
   14. La transferencia de las SEC limpias a los seis grandes placas de Petri de vidrio y seca en una campana de extracción a temperatura ambiente durante 24 horas para eliminar todo el contenido de agua.
   15. Se secan las SEC en un horno de vacío a 60 ° C y 1 mbar de vacío durante 10 horas o hasta peso constante.
   16. Recoger la SEC seca y transferir a una botella de polipropileno.
   17. Almacenar la SEC en un armario seco.

2. Caracterización de los SEC

1. Realizar electrónica de barrido análisis microscópico ⁴¹ utilizando esporas y SEC producidos en diferentes etapas.
2. Realizar análisis elemental ⁴¹ utilizando esporas y SEC producidos en diferentes etapas. rery todas las muestras a 60 ° C durante al menos 1 hora antes del análisis elemental y calcular el contenido de proteína usando por ciento de nitrógeno, con un factor de multiplicación de 6,25. ¹¹ obtener resultados utilizando mediciones por triplicado para cada muestra.
3. Realizar un análisis de las propiedades micromeritic usando un analizador de partículas imagen dinámica. ⁴¹
4. Analiza no procesado, procesado, y los SEC FITC-BSA-cargados mediante microscopía confocal de barrido láser. ⁴¹

3. biomacromolécula encapsulación por vacío Cargando Técnica

1. Preparar 1,2 ml de 125 mg / ml solución de albúmina de suero bovino (BSA) usando agua DI y la transferencia a un tubo de polipropileno de 50 ml.
2. Pesar 150 mg de los CEE y la transferencia a la solución de BSA.
3. Vortex el tubo durante 10 min para formar una solución homogénea.
4. Cubrir el tubo con papel de filtro.
5. Transferir el tubo a un matraz liofilizador y secar durante 4 horas con vacío a 1 mbar.
6. Realice los pasos 3.1a 3,5. para tres lotes independientes.
7. Recoger la SEC cargadas con BSA y eliminar los aglomerados mediante el uso de un mortero.
8. La transferencia de las SEC BSA-cargados a un tubo de 50 ml y añadir agua DI 2 ml para eliminar el residuo de BSA.
9. Recoger las SEC por centrifugación a 4.704 xg durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
10. Repetir el lavado con agua DI vez.
11. Cubrir el tubo que contiene los SEC cargadas con BSA utilizando papel de filtro.
12. La transferencia de los segundos para un congelador (-20 ° C) y congelar durante 1 hora.
13. Liofilizar la SEC durante 24 horas y guardar en un congelador hasta su posterior caracterización.
14. Preparar las SEC placebo sin BSA utilizando el mismo procedimiento que en los pasos 3.1. a 3.13.
15. Preparar las SEC cargados FITC-BSA usando el mismo procedimiento que en los pasos 3.1. a 3.13.

4. Determinación de la eficiencia de encapsulación

1. Pesar 5 mg de BSA SEC-cargadas en tubos de 2 ml de polipropileno.
2. Añadir 1,4 ml fosfate solución salina tamponada de pH 7,4 (PBS) y agitar durante 5 min.
3. Sonda sonicar la suspensión a 40% de amplitud durante 3 ciclos de 10 seg.
4. Se filtra la solución con un filtro de 0,45 micras de polietersulfona (PES).
5. Realice el mismo procedimiento que en los pasos 4.1. a 4,4. utilizando los SEC placebo.
6. Medir la absorbancia a 280 nm utilizando un placebo como blanco.
7. Cuantificar la cantidad de BSA encapsulado utilizando una curva estándar de BSA (200 a 1.000 g / ml) en PBS. ⁴²

Resultados

Proceso de extracción optimizada para sporopollenin exina Cápsulas

El L. extracción clavatum SEC se logró mediante tres pasos principales: (1) degradación de grasa usando acetona; (2) La acidolisis usando ácido fosfórico al 85% (v / v); y (3) Amplia lavado SEC uso de disolventes. El flujo del proceso de extracción SEC simplificado se presenta en la Figura 1 A -. I Bre...

Discusión

En este trabajo, un análisis sistemático de la extracción de la SEC L. esporas clavatum se presenta y este informe muestra que es posible producir cápsulas de mayor calidad mientras que también el logro de una simplificación significativa de la pre-existente protocolo utilizado comúnmente. ¹¹ En contraste con el protocolo existente que requiere una alta temperatura del proceso (180 ° C) y una larga duración del proceso (7 días), ¹¹ la corriente de la optimización de pro...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220