高效抗体标记由应变叠氮推广 - 炔环加成特定站点

摘要

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

摘要

有可用的化学探针引入蛋白质以研究它们的结构和功能目前许多化学的工具。一种有用的方法是蛋白质缀合通过基因引入含有生物正交官能团的非天然氨基酸。这份报告介绍了位点特异性抗体偶联了详细的方案。该协议包括用于含叠氮氨基酸的遗传掺入，并通过应变促进的叠氮化物 - 炔环加成（SPAAC）的缀合反应的实验细节。该菌株促进的反应通过在生理pH和温度的反应的分子的简单混合进行，并且不需要另外的试剂如铜（I）离子和铜的螯合配体。因此，这种方法将是一般蛋白质偶联和抗体药物偶联物（ADC）的开发是有用的。

引言

由于在大肠杆菌 p -methoxyphenylalanine的遗传掺入报道^，1 100多的非天然氨基酸（UAAs）已经被成功地结合到各种蛋白质。 ^1-3在这些UAAs，含生物正交功能基的氨基酸已被广泛研究，并代表的比例最大。在UAAs使用的生物正交功能团包括酮^，4-叠氮基^，5炔^{，6 cyclooctyne，7}四嗪^，8α，β不饱和酰胺^，9降冰片烯^{，10 transcyclooctene，11}和二环[6.1.0] -nonyne。 ¹¹虽然每个官能团都有其优点和缺点，在含叠氮基氨基酸被最广泛地用于蛋白质缀合。 p -Azidophenylalanine（AF），含叠氮基氨基酸之一，是容易得到的，它的掺入efficiency优异。含该氨基酸的突变蛋白可以通过铜催化环加成或与由SPAAC cyclooctynes炔进行反应。 ^12-20

近日，生物制药已在制药行业中引起极大关注。抗体-药物缀合物（ADC）是一类是有利的治疗性抗体的，由于其对人类癌症²¹和治疗靶向治疗能力 等疾病。超过50的ADC是目前在临床试验中，并且数量正在迅速增加。 ADC中的发展，需要考虑到最大限度的效力和减少副作用的许多因素。在这些因素中，一个高效的和位点特异性缀合反应以形成抗体之间形成共价键和一个药物是至关重要的。在缀合反应所需的效率和特异性可以通过缀合有生物正交功能组中的一个来实现是专门结合到抗体的非天然氨基酸。 ^22-26在这里，我们报告一个协议来位点特异性结合 AF成的抗体片段和缀合的突变体抗体片段与生物化学探针。

研究方案

1.质粒构建

1. 构建一个表达质粒（的pBAD-HerFab-L177TAG），将表达靶抗体基因（的pBAD-HerFab-WT）用他的₆ -tag，并用琥珀密码子取代为亮氨酸177的密码子^{（TAG）27，}用常规定点诱变技术。
   见材料表 。
2. 构建包含演进的tRNA ^酪氨酸和氨酰tRNA合成酶（的aaRS）对所述基因另一个表达质粒（pEVOL-AFRS）。使用专门设计的质粒载体，pEVOL，为UAAs的有效结合。详细的信息载体和克隆的协议在之前的报告中已经提到。 ²⁸
3. 通过使用可商购的质粒制备试剂盒获得的高质量的质粒DNA。 260/280比率〜1.8的最适合的纯化的DNA。如果需要的话，则执行1％琼脂糖凝胶电泳来检查DNA的纯度。

2。培养制备

1. 电穿孔
   1. pEVOL-AFRS ²⁸的pBAD-HerFab-L177TAG各1μLDNA添加到20μL 大肠杆菌菌株DH10β。轻轻混匀，用移液管。质粒可以一起或独立的反应被转化。
   2. 对于0.1厘米比色皿，设置电设置25μF和2.5千伏。
   3. 将试管放入震撼室的幻灯片。推滑入室，直到试管使得与室电极紧密接触。
   4. 按脉冲按钮，直到电机发出哔哔声脉冲一次。
   5. 加入1毫升含有分解代谢物阻抑（SOC）培养基2％（重量/体积）胰蛋白胨，0.5％（重量/体积）酵母提取物，10mM的氯化钠，2.5mM的氯化钾，10mM的MgCl ₂的超级最佳肉汤，和20mM葡萄糖到试管迅速将混合物转移到一个试管中。孵育1小时将细胞在37℃振荡。
   6. 传播转化的大肠杆菌细胞在LB培养基（LB）琼脂含适当的抗生素（35微克/毫升氯霉素和100μg/ mL氨苄青霉素，用于选择pEVOL-AFRS和分别的pBAD-HerFab-L177TAG，）板。孵育在37℃下将板进行12小时。
2. 文化准备
   1. 接种在5毫升LB培养基含有抗生素的单一转化殖民地。在37℃振荡孵育12小时。

3.表达HerFab-L177AF纯化

1. HerFab-L177AF的表达
   1. 传送主培养（5毫升）到200ml的LB培养基含有氨苄青霉素（100微克/毫升）和AF（1毫米），接着温育，在37℃振荡。
      注:100mM的AF原液（10毫升）溶液通过在100mM溶解206毫克的AF盐酸（10毫升，最终体积）制备。
   2. 加入2毫升的1.6M的阿拉伯糖（16毫终浓度）时培养物达到对数期（OD ₅₅₀ = 0.8，OD =光学密度）。在30℃振荡孵育12小时。
   3. 收获细胞，离心在11000×g离心5分钟。弃上清，在-20℃冷冻沉淀。
2. 细胞裂解
   1. 重悬在含有30毫摩尔Tris（pH值8.0），1mM EDTA中，20％的蔗糖和0.2毫克/毫升溶菌酶20毫升周质溶胞缓冲液的细胞沉淀，并在37℃下孵育混合物1小时。
   2. 离心细胞裂解物以18,000rpm xg离心在4℃下15分钟。将上清转移到新的管中，并弃沉淀。
3. 的Ni-NTA亲和层析
   1. 添加的Ni-NTA树脂悬浮于每个离心管中（400微升树脂的200mL培养物），并在4℃下1小时轻轻混匀。
   2. 倒入悬浮液成聚丙烯柱和三次用5mL洗涤蒲式耳洗涤树脂FFER含有50mM的NaH ₂ PO _4（pH 8.0）中，20 mM咪唑，和300mM NaCl的。
   3. 洗脱用含有50mM的NaH ₂ PO _4（pH为8.0），250mM咪唑，和300mM NaCl的300微升的洗脱缓冲液的目标抗体。
   4. 确定由Bradford蛋白测定²⁹或通过测量280nm处的吸光度的突变蛋白的浓度。通过使用用于自动对焦的消光系数（2471 M ^{-1 -1）}蛋白质消光系数计算器计算HerFab-L177AF消光系数（75866 M ^{-1 -1）}在280纳米。
      注:HerFab的氨基酸序列可以在NCBI网站（GI:783282791和GI:783282792）。

4.纯化HerFab-L177AF与炔探头的共轭使用应变促进叠氮炔环加成（SPAAC）

1. H中₂ O添加经Cy5.5 Azadibenzocyclooctyne（经Cy5.5艾迪宝）20μL（20081，M终浓度）至HerFab-L177AF10μL的（10μM终浓度）在含有10mM _的 Na ₂ HPO _4（pH7.0）中和100mM NaCl的磷酸盐缓冲液的溶液。
   注意:作为替代方案，二氟化cyclooctyne（DIFO）和二环[6.1.0] nonyne（BCN）的衍生物也可用于相同的应用。
2. 允许应变促进的环加成反应，以在37℃下继续进行6小时。如果光敏探测器 （ 如经Cy5.5）时，用铝箔覆盖的反应容器中。
3. 根据步骤5纯化标记HerFab。

5.净化标记HerFab的

1. （0807）500μL于离心式过滤器离心柱。
2. 在14000 xg离心离心旋转柱在4℃15分钟。
3. 废弃流过和转移从旋转柱到1.5mL微量离心管中纯化的样品。
4. 作为替代步骤5.1- 5.3，执行purifica通过针对相同缓冲液透析和灰。
5. 存储纯化的标记HerFab在4℃。

标记HerFab 6. SDS-PAGE分析

1. 添加含有106毫摩尔Tris·HCl的，141毫摩尔Tris碱（pH为8.5），2％的LDS，10％甘油，0.51毫摩尔EDTA，0.22毫SERVA蓝G250，和0.175毫摩尔酚红以13微升5微升LDS蛋白质样品缓冲液在存在（+）或不存在纯化的标记HerFab（7.8微米或0.38毫克/毫升）（ - ）2微升二硫苏糖醇（DTT，100mM的终浓度）。孵育在95℃下该混合物10分钟。
2. 附加4-12％的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶盒的电泳细胞并添加缓冲液。加载轭蛋白质样品与预染的分子量标志物。在200五35分钟进行凝胶电泳
   注意:保持在黑暗中的电泳单元中的整个期间，以尽量减少荧光团的光致漂白。
3. 电泳后，转移该凝胶的荧光凝胶扫描仪，并在适当的波长扫描荧光发射。对于经Cy5.5，使用扫描仪软件Cy5的模式。
4. 染色用市售的蛋白质染色的凝胶。

结果

在这项研究中，抗体片段是位点特异性通过将一种含叠氮基氨基酸插入片段和突变体抗体片段与应变cyclooctyne反应用荧光团缀合（ 图1）。 HerFab被选为到其中的AF被合并为含叠氮基氨基酸的靶抗体片段。选择在HerFab残余物为带有AF更换，HerFab的X射线晶体结构进行了分析。对残余物³⁰的重要要求包括来自抗体结合位点足够的距离，以尽量减少有效的缀...

讨论

的非天然氨基酸遗传掺入蛋白质具有在用于蛋白质修饰的其它方法的几个优点。 ^1-3其中一个重要的优点是它的通用性的任何种类的蛋白质。原则上，存在选择目标蛋白质和该蛋白质的目标部位没有限制。然而，替换为结构上或功能上重要的残基的一个UAA可能导致改变靶蛋白的结构和功能。通常，暴露于溶剂，并且不与其他残基相互作用的残基被选择用于UAAs的掺入。因此，从一个高分辨率...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS			Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Ethidium bromide	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium	Wako	018-10372	25 g
Chloramphenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)	Bachem	F-3075.0001	1 g
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Hydrochloric acid, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%	SAMCHUN	E0064	1 kg
Sucrose	Sigma	S9378	500 g
Lysozyme	Siyaku	126-0671	1 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	25 mL
Polypropylene column	QIAGEN	34924	50/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%	SAMCHUN	I0578	1 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Sodium Chloride, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	MILLIPORE	UFC500396	96/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels	Thermofisher	NO0321	12-well
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
Typhoon 9210 variable mode imager	Amersham Biosciences