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Resumo

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Resumo

Atualmente muitas ferramentas químicas disponíveis para introduzir sondas químicas em proteínas para estudar sua estrutura e função. Um método útil é a conjugação de proteínas geneticamente pela introdução de um aminoácido não natural contendo um grupo funcional bioorthogonal. Este relatório descreve um protocolo detalhado para site-specific a conjugação de anticorpos. O protocolo inclui detalhes experimentais para a incorporação genética de um aminoácido contendo azida, e a reacção de conjugação por cicloadição azida-alcino promoveu-deformação (SPAAC). Esta reacção promovida por deformação prossegue por mistura simples das moléculas de reacção a pH e temperatura fisiológicos, e não requer reagentes adicionais, tais como cobre (I) e os iões ligandos quelantes de cobre. Por conseguinte, este método seria útil para a conjugação de proteínas em geral e ao desenvolvimento de conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs).

Introdução

Uma vez que a incorporação genética de p -methoxyphenylalanine em Escherichia coli foi relatado, 1 mais de 100 aminoácidos não naturais (UAAS) foram incorporados com sucesso em várias proteínas. 1-3 Entre estes UAAS, os aminoácidos contêm grupos funcionais bioorthogonal têm sido extensivamente estudados e representam a maior proporção. Os grupos funcionais bioorthogonal utilizados nos UAAS incluem cetona, 4 azida, alcino 5, 6 cyclooctyne, tetrazina 7, 8 α, amida β-insaturado, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Embora cada grupo funcional tem as suas vantagens e desvantagens, os aminoácidos contendo azida foram mais extensivamente utilizada para a conjugação de proteínas. p -Azidophenylalanine (AF), um dos aminoácidos contendo azido, está prontamente disponível, e a sua incorporação efficiency é excelente. pode-se fazer reagir as proteínas mutantes contendo este aminoácido com alcinos por cicloadição catalisada por cobre ou com cyclooctynes ​​por SPAAC. 12-20

Recentemente, biofármacos têm atraído muita atenção na indústria farmacêutica. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é uma classe de anticorpos terapêuticos que são vantajosos devido à sua capacidade para terapia-alvo para o tratamento de cancros humanos e 21 outras doenças. Mais de 50 ADCs estão actualmente em ensaios clínicos, eo número está aumentando rapidamente. No desenvolvimento dos ADCs, muitos factores devem ser considerados para maximizar a eficácia e minimizar os efeitos colaterais. Entre estes factores, a reacção de conjugação eficiente e específica do local para formar uma ligação covalente entre um anticorpo e um fármaco é crítica. A eficiência e especificidade desejada na reacção de conjugação pode ser conseguida por conjugação com um grupo funcional numa bioorthogonalaminoácido não natural que é especificamente incorporada num anticorpo. 22-26 Aqui, nós relatamos um protocolo para o site especificamente incorporar AF em um fragmento de anticorpo e o conjugado do fragmento de anticorpo mutante com uma sonda bioquímica.

Protocolo

1. O plasmídeo Construção

  1. Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-HerFab-L177TAG) que expressam o gene do anticorpo alvo (pBAD-HerFab-WT) com um Sua 6-tag, e substituir o codão para a leucina-177 com o códon de âmbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénese dirigida ao local convencional.
    Veja a Tabela de Materiais.
  2. Construir outro plasmídeo de expressão (pEVOL-AFRS) contendo os genes para o tRNA Tyr evoluiu e aminoacil-tRNA sintetase par (RAA). Use o vector plasmídeo especialmente concebido, pEVOL, para incorporação eficiente do UAAS. Os protocolos de informação plasmídeo e clonagem detalhadas são descritas no relatório anterior. 28
  3. Obter DNA de plasmídeo de alta qualidade, utilizando kits de preparação de plasmídeos disponíveis comercialmente. A proporção de ~ 1,8 260/280 é óptima para o ADN purificado. Se necessário, realizar uma% de electroforese em gel de agarose para verificar a pureza do ADN.

2. Preparação cultura

  1. eletroporação
    1. Adicione cada DNA 1 mL de pEVOL-AFRS 28 e pBAD-HerFab-L177TAG a 20 mL Escherichia coli DH10β tensão. Misturar suavemente, usando uma pipeta. Os plasmídeos podem ser transformados em conjunto ou em reacções independentes.
    2. Para 0,1 cm cuvetes, defina as configurações de eletroporação a 25 mF e 2,5 kV.
    3. Coloque a célula no slide da câmara chocante. Empurrar o slide para a câmara até a tina fique em contato firme com os eletrodos de câmara.
    4. Pulsar uma vez, premindo o botão de pulso até que os bips máquina eletroporação.
    5. Adicionar 1 mL de super caldo óptima com catabólica repressão (SOC) meio contendo 2% (w / v) de triptona, 0,5% (w / v) de extracto de levedura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, e glucose a 20 mM rapidamente à cuvete e transferir a mistura para um tubo de ensaio. Incubam-se as células durante 1 h a 37 ° C com agitação.
    6. Células de E. coli transformada E. espalhadas sobre Lisogenia Broth (LB) agar contendo os antibióticos apropriados (35 ug / ml de cloranfenicol e 100 ug / ml de ampicilina para selecção pEVOL-RSFA e pBAD-HerFab-L177TAG, respectivamente). Incubar as placas a 37 ° C durante 12 h.
  2. preparação de cultura
    1. Inocular uma única colónia transformada em 5 mL de meio LB contendo antibióticos. Incubar durante 12 h a 37 ° C com agitação.

3. Expressão e Purificação de HerFab-L177AF

  1. Expressão de HerFab-L177AF
    1. Transferir a cultura primária (5 mL) em 200 mL de meio LB contendo ampicilina (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguido de incubação a 37 ° C com agitação.
      NOTA: solução estoque AF 100 mM (10 ml) foi preparada por dissolução de 206 mg de FA em 100 mM de ácido clorídrico (10 ml, volume final).
    2. Adicionar 2 mL de 1,6 M arabinose (16concentração final mM) quando a cultura atingir a fase log-(OD550 = 0,8, DO = densidade óptica). Incubar durante 12 h a 30 ° C com agitação.
    3. Células colheita por centrifugação a 11000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e congelar o sedimento a -20 ° C.
  2. A lise celular
    1. Ressuspender os sedimentos celulares em 20 ml de tampão de lise periplasmática contendo 30 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, sacarose a 20%, e 0,2 mg / ml de lisozima, e incubar a mistura durante 1 h a 37 ° C.
    2. Centrifuga-se o lisado celular a 18000 xg, a 4 ° C durante 15 min. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e descartar o sedimento.
  3. Cromatografia de afinidade de Ni-NTA
    1. Adicionar a suspensão de resina de Ni-NTA para cada tubo de centrifugação (400 mL de resina de uma cultura de 200 mL), e agitar suavemente a 4 ° C durante 1 h.
    2. Verter a suspensão em uma coluna de polipropileno e lavar a resina três vezes com 5 mL de lavagem buffer contendo 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazole 20 mM, e NaCl 300 mM.
    3. Elui-se o anticorpo alvo com tampão de eluição de 300 uL contendo 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazole 250 mM e NaCl 300 mM.
    4. Determinar a concentração de proteína mutante por Bradford ensaio de proteína de 29 ou através da medição da absorvância a 280 nm. Calcular o coeficiente de extinção (75866 M-1cm-1) para HerFab-L177AF a 280 nm pelo coeficiente de extinção da proteína calculadora utilizando o coeficiente de extinção (2471 M-1cm-1) para AF.
      NOTA: A sequência de aminoácidos de HerFab pode ser encontrada no site do NCBI (GI: 783282791 e GI: 783282792).

4. Conjugação de Purificada HerFab-L177AF com Alcino Sondas Usando cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain (SPAAC)

  1. Adicionar 20 ul de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) em H2O (20081; M de concentração final) a uma solução de 10 mL de HerFab-L177AF (10 uM de concentração final) em tampão de fosfato contendo 10 mM de Na 2 HPO 4 (pH 7,0) e NaCl 100 mM.
    NOTA: Como alternativas, cyclooctyne difluorinated (DIFO) e biciclo [6.1.0] nonino derivados (BCN) também estão disponíveis para a mesma aplicação.
  2. Permitir que a reacção de cicloadição promoveu-estirpe prosseguir durante 6 h a 37 ° C. Se é usada uma sonda sensível à luz (por exemplo, Cy5.5), cobrir o vaso de reacção com uma folha de alumínio.
  3. Purificar o HerFab rotuladas de acordo com a etapa 5.

5. Purificação de HerFab Labeled

  1. Adicionar 500 ul de amostra a uma coluna de centrifugação filtro centrífugo.
  2. Centrifugar a coluna de centrifugação a 14.000 xg, a 4 ° C durante 15 min.
  3. Rejeitar de fluxo e de transferência de amostra purificada a partir da coluna de spin para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  4. Como uma alternativa para a etapa 5.1- 5.3, executar Purificação por diálise contra o mesmo tampão.
  5. Armazenar o HerFab purificado marcado a 4 ° C.

6. SDS-PAGE Análise de HerFab Rotulado

  1. Adicionar tampão de amostra de proteína de 5 uL de LDS contendo 106 mM Tris-HCl, Tris base 141 mM (pH 8,5), 2% de LDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM, 0,22 mM SERVA azul G250, e fenol 0,175 mM de vermelho a 13 uL de purificado marcado HerFab (7,8 ^ M ou 0,38 mg / mL) na presença (+) ou ausência (-) de 2 ul de ditiotreitol (DTT, 100 mM de concentração final). Incubar a mistura a 95 ° C durante 10 min.
  2. Anexar o Bis-Tris cassete de gel de SDS-PAGE a 4-12% para a célula de electroforese e adicionar tampão de corrida. Coloque as amostras de proteína conjugados e o marcador de peso molecular pré-manchado. Efectuar a electroforese de gel durante 35 min a 200 V.
    Nota: manter a célula de electroforese no escuro durante todo o período para minimizar o foto-branqueamento do fluoróforo.
  3. Após a electroforese, a transferênciao gel a um scanner de gel fluorescente, e verificar se há emissão de fluorescência no comprimento de onda apropriado. Para Cy5.5, utilize o modo Cy5 no software do scanner.
  4. Manchar o gel com uma mancha de proteína comercial.

Resultados

Neste estudo, um fragmento de anticorpo foi local especificamente conjugado com um fluoróforo por incorporação de um aminoácido contendo azida no fragmento e fazendo reagir o fragmento de anticorpo mutante com um cyclooctyne tensas (Figura 1). HerFab foi seleccionado como o fragmento de anticorpo-alvo em que AF foi incorporado como um aminoácido contendo azida. Para escolher o resíduo em HerFab para a substituição com FA, foi analisada a estrutura de crista...

Discussão

A incorporação genética de aminoácidos não naturais em proteínas tem várias vantagens sobre outros métodos utilizados para a modificação de proteínas. 3/1 Uma das vantagens importantes é a sua aplicabilidade em geral a qualquer tipo de proteína. Em princípio, não há limitação na escolha de uma proteína alvo e um local alvo da proteína. No entanto, a substituição de um resíduo estruturalmente ou funcionalmente importante com um UAA pode resultar na alteração da estrutura e função da ...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAGOptionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulserBIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SucroseSigmaS9378500 g
LysozymeSiyaku126-06711 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4xThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112-well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 variable mode imagerAmersham Biosciences

Referências

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

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