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要約

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

要約

その構造と機能を研究するためにタンパク質に化学プローブを導入するために利用可能な多くの化学ツールは現在ありません。有用な方法は、遺伝的にバイオ直交官能基を有する非天然アミノ酸を導入することによって、タンパク質結合です。このレポートには、サイト固有の抗体結合のための詳細なプロトコルを記述しています。プロトコルは、アジド含有アミノ酸の遺伝的取り込み、および歪み促進アジド - アルキン付加環（SPAAC）によって結合反応のための実験の詳細が含まれています。この株促進反応は、生理的pHおよび温度で反応する分子を単純に混合することによって進行し、例えば、銅（I）イオンと銅キレートリガンドなどの追加の試薬を必要としません。したがって、この方法は、一般的なタンパク質の結合および抗体薬物複合体（ADCの）の開発に有用であろう。

概要

大腸菌 におけるP -methoxyphenylalanineの遺伝的取り込みが報告されて以来、1、100以上の非天然アミノ酸（UAAs）が正常に様々なタンパク質に組み込まれています。 1-3これらのUAAsの中で、バイオ直交官能基を含むアミノ酸は、広く研究さと最大の割合を表してきました。 UAAsで使用されるバイオ直交官能基は、ケトン、4アジド、5アルキン、6シクロオクチン、7テトラジン、8α、β不飽和アミド、9ノルボルネン、10 transcyclooctene、11およびビシクロ[6.1.0] -nonyneが含まれます。各官能基は、その長所と短所を持っている11が、アジド含有アミノ酸は、最も広範にタンパク質結合に使用されてきました。 P -Azidophenylalanine（AF）、アジド含有アミノ酸の一つは、容易に入手可能であり、その取り込みefficiencyが優れています。このアミノ酸を含有する変異体タンパク質は、銅触媒による付加環化によって、またはSPAACによってcyclooctynesとアルキンと反応させることができます。 12月20日

最近、バイオ医薬品は、製薬業界で大きな注目を集めています。抗体-薬物複合体（ADC）が原因で、ヒトの癌21の治療のための標的治療のためのそれらの能力に有利である治療用抗体のクラスであり、 他の疾患。 50以上のADCは現在臨床試験中であり、その数は急速に増加しています。 ADCの開発では、多くの要因が有効性を最大化し、副作用を最小限にするために考慮される必要があります。これらの要因の中でも、抗体と薬物との間に共有結合を形成するための効率的かつ部位特異的コンジュゲーション反応は重要です。コンジュゲーション反応における所望の効率及び特異性にバイオ直交官能基と結合することによって達成することができます具体的に抗体に組み込まれる非天然アミノ酸。ここで22-26、我々は、部位特異的に組み込むためのプロトコルを報告します 抗体断片にAFとは、生化学的プローブと変異型抗体断片を結合します。

プロトコル

1.プラスミド構築

  1. 彼の6タグを有する標的抗体遺伝子（のpBAD-HerFab-WT）を発現し、アンバーコドン（TAG）とロイシン-177のコドンに代わる発現プラスミド（のpBAD-HerFab-L177TAG）を構築27、使用して従来の部位特異的変異誘発技術。
    材料の表を参照してください。
  2. 進化したtRNA TyrおよびアミノアシルtRNA合成酵素（aaRS）ペアの遺伝子を含む別の発現プラスミド（pEVOL-AFRS）を構築します。 UAAsの効率的な取り込みのために、特別に設計されたプラスミドベクター、pEVOLを使用してください。詳細プラスミド情報およびクローニングプロトコルは、以前の報告書に記載されています。 28
  3. 市販のプラスミド調製キットを用いて高品質のプラスミドDNAを得ました。 〜1.8の260/280比は、精製されたDNAに最適です。必要であれば、DNAの純度を確認するために1％アガロースゲル電気泳動を行います。

2。文化の準備

  1. エレクトロポレーション
    1. 20μL 大腸菌 DH10β株にpEVOL-AFRS 28とのpBAD-HerFab-L177TAGの各1μLのDNAを追加します。ピペットを用いて、穏やかに混合します。プラスミドは、一緒にまたは独立した反応で形質転換することができます。
    2. 0.1センチメートルキュベットについては、25μFと2.5 kVでのエレクトロポレーションの設定を行います。
    3. 衝撃的なチャンバーのスライドにキュベットを挿入します。キュベットは、チャンバ電極としっかり接触するまでチャンバー内にスライドを押してください。
    4. エレクトロポレーションマシンのビープ音まで、パルスボタンを押すことで、一度パルス。
    5. カタボライト抑制（SOC）培地は、酵母エキス、10mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム（w / v）のトリプトン、0.5％（w / v）の、10mMのMgCl 2を2重量％含有する1mLの超最適ブロス、及び20mMのグルコースを追加キュベットへの迅速かつ試験管に混合物を移します。振盪しながら37℃で1時間、細胞をインキュベートします。
    6. （pEVOL-AFRSそれぞれのpBAD-HerFab-L177TAGを、選択するための35μgの/ mLクロラムフェニコールおよび100μg/ mLのアンピシリン）適切な抗生物質を含む寒天プレートLB培地（LB）のスプレッド形質転換された大腸菌細胞 。 12時間37℃で培養します。
  2. 文化の準備
    1. 抗生物質を含有する5mLのLB培地に単一形質転換コロニーを接種します。振盪しながら37℃で12時間インキュベートします。

HerFab-L177AFの3発現および精製

  1. HerFab-L177AFの発現
    1. 振盪しながら37℃でインキュベートし、アンピシリン（100μg/ ml）およびAF（1ミリモル）を含有する200mLのLB培地の中に初代培養物（5ml）に移します。
      注：100mMのAFストック溶液（10mL）を100mM塩酸（10mLの最終体積）に206 mgのAFを溶解することによって調製しました。
    2. （16を1.6 Mアラビノースの2 mLを加え培養物が対数期（OD 550 = 0.8、OD =光学密度）に達するmMの最終濃度）。振盪しながら30℃で12時間インキュベートします。
    3. 5分間、11,000×gで遠心分離によって細胞を回収します。上清を捨て、-20℃でペレットを凍結します。
  2. 細胞溶解
    1. 30 mMトリス（pHは8.0）、1mMのEDTA、20％スクロース、および0.2 mg / mlでリゾチームを含む20mLのペリプラズム溶解用緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁し、そして37℃で1時間混合物をインキュベートします。
    2. 15分間4℃で18,000×gで細胞溶解物を遠心。上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。
  3. Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー
    1. 各遠心分離管（200 mLの培養のための400μL樹脂）へのNi-NTA樹脂懸濁液を追加し、4℃で1時間穏やかに混合します。
    2. ポリプロピレンカラムにサスペンションを注ぎ、5 mLの洗浄府で樹脂を3回洗浄fferの50mMのNaH 2 PO 4（pH8.0）で、20 mMイミダゾール、および300 mMのNaClを含みます。
    3. 50mMのNaH 2 PO 4（pHは8.0）、250 mMイミダゾール、および300 mMのNaClを含有する300μLの溶出緩衝液を用いて目的とする抗体を溶出させます。
    4. Bradfordタンパク質アッセイ29によって、または280nmでの吸光度を測定することにより変異体タンパク質の濃度を決定します。吸光係数（2471 M -1 cm -1 で ）AF用を使用して、タンパク質の吸光係数の計算により280 nmでHerFab-L177AFの吸光係数（75866 M -1センチ-1）を計算します。
      注：HerFabのアミノ酸配列は、NCBIのウェブサイトで見つけることができます（GI：783282791とGI：783282792）。

ひずみ促進アジド - アルキン付加環を使用してアルキンプローブを用いて精製したHerFab-L177AFの4コンジュゲート（SPAAC）

  1. （H 2 Oで200のCy5.5-Azadibenzocyclooctyne（のCy5.5-ADIBO）の20μLを追加します。81; 10mMののNa 2 HPO 4（pH7.0）に100mMのNaClを含むリン酸緩衝液中HerFab-L177AFの10μL（最終濃度10μM）の溶液にM最終濃度）。
    注：代替、ジフルオロシクロオクチン（DIFO）およびビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）誘導体も、同じアプリケーションで使用できます。
  2. 歪み促進付加環化反応は、37℃で6時間進行させます。感光性プローブ（ 例えば、Cy5.5の）が使用される場合、アルミニウム箔で反応容器を覆います。
  3. ステップ5に従って標識HerFabを精製します。

標識HerFab 5.精製

  1. 遠心分離フィルタースピンカラムにサンプルの500μLを追加します。
  2. 15分間、4℃、14,000×gでスピンカラムを遠心します。
  3. フロースルーを捨て、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムから精製されたサンプルを転送します。
  4. 5.3 5.1-ステップに代わるものとして、purificaを行います同緩衝液に対して透析することによりる。
  5. 4℃で精製し、標識HerFabを保管してください。

標識HerFabの6 SDS-PAGE分析

  1. 106 mMトリス・塩酸、141 mMのトリス塩基（pHは8.5）、2％LDS、10％グリセロール、0.51 mMのEDTA、0.22 mMのSERVAブルーG250、および13μLに赤の0.175 mMのフェノールを含む5μLLDSタンパク質サンプルバッファーを追加します。 2μLのジチオスレイトール（DTT、100mMの最終濃度）の（ - ）の存在（+）または非存在下で標識されたHerFab（7.8μMまたは0.38ミリグラム/ mL）を精製しました。 10分間95℃で混合物をインキュベートします。
  2. 電気泳動セルに4〜12％のBis-Tris SDS-PAGEゲルカセットを取り付け、バッファを実行して追加します。共役タンパク質試料と前染色分子量マーカーをロードします。 200 Vで35分間電気泳動を行います
    注：蛍光体の光退色を最小限にするために全期間の間、暗闇の中での電気泳動セルを保管してください。
  3. 電気泳動後、転送蛍光ゲルスキャナーにゲル、および適切な波長での蛍光発光をスキャン。 Cy5.5のために、スキャナソフトウェアでCy5のモードを使用します。
  4. 市販のタンパク質染色でゲルを染色。

結果

本研究では、抗体断片は、部位特異的フラグメントにアジド含有アミノ酸を組み込んでいると歪みシクロオクチン（ 図1）を用いて変異体抗体断片を反応させることにより、フルオロフォアとコンジュゲートしました。 HerFabはAFがアジド含有アミノ酸として組み込んだ標的抗体フラグメントとして選択しました。 AFとの交換のためHerFab中の残留物を選...

ディスカッション

タンパク質への非天然アミノ酸の遺伝的組込みは、タンパク質修飾のために使用される他の方法に比べていくつかの利点を有しています。 1-3重要な利点の一つは、タンパク質の任意の種類への一般的な適用です。原理的には、標的タンパク質とタンパク質の標的部位を選択するには制限がありません。しかし、UAAと構造的または機能的に重要な残基の置換​​は、標的タンパク質の?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAGOptionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulserBIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SucroseSigmaS9378500 g
LysozymeSiyaku126-06711 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4xThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112-well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 variable mode imagerAmersham Biosciences

参考文献

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