Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

Zusammenfassung

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Zusammenfassung

Derzeit gibt es viele chemische Werkzeuge zur Verfügung, chemische Sonden in Proteine ​​einzuführen ihrer Struktur und Funktion zu untersuchen. Ein geeignetes Verfahren ist Proteinkonjugation durch genetisch eine unnatürliche Aminosäure Einführen einer bioorthogonale funktionelle Gruppe enthalten. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Protokoll für die ortsspezifische Antikörper-Konjugation. Das Protokoll umfasst die experimentelle Details für die genetische Einbau eines azidhaltigen Aminosäure und die Konjugationsreaktion durch dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC). Dieser Stamm-vermittelte Reaktion verläuft durch einfaches Mischen der reagierenden Moleküle bei physiologischem pH-Wert und Temperatur, und erfordert keine zusätzlichen Reagenzien wie Kupfer (I) -Ionen und Kupfer-Chelat-Liganden. Daher würde diese Methode für die allgemeine Proteinkonjugation und Entwicklung von Antikörper-Arzneimittel-Konjugate (ADCs) nützlich sein.

Einleitung

Da der genetische Einbau von p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli wurde berichtet, ¹ mehr als 100 unnatürliche Aminosäuren (UAAs) wurden in verschiedene Proteine erfolgreich eingebaut. ^1-3 Unter diesen UAAs die Aminosäuren bioorthogonale funktionellen Gruppen wurden intensiv untersucht und stellen den größten Anteil enthält. Die bioorthogonale funktionellen Gruppen in den UAAs verwendet werden , umfassen Ketone, ⁴ Azid, ⁵ Alkin, ⁶ Cyclooctin, ⁷ Tetrazin, ⁸ α, β-ungesättigten Amids, ⁹ Norbonen, ¹⁰ transcyclooctene, ¹¹ und Bicyclo [6.1.0] -nonyne. ¹¹ Obwohl jede funktionelle Gruppe ihre Vor- und Nachteile hat, die azidhaltigen Aminosäuren am intensivsten wurden für die Protein Konjugation verwendet. p -Azidophenylalanine (AF), eine der Azido-enthaltenden Aminosäuren, ist leicht verfügbar, und ihre Inkorporation efficiency ist ausgezeichnet. Mutant Proteine ​​diese Aminosäure enthalten, können mit Alkinen durch Kupfer-katalysierte Cyclo oder mit Cyclooctenen von SPAAC umgesetzt werden. ^12-20

In letzter Zeit wurden Biopharmazeutika große Aufmerksamkeit in der pharmazeutischen Industrie zu gewinnen. Der Antikörper-Arzneimittel - Konjugat (ADC) ist eine Klasse von therapeutischen Antikörpern , die aufgrund ihrer Fähigkeit zur gezielten Therapie für die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen ²¹ vorteilhaft sind und anderen Krankheiten. Mehr als 50 ADCs sind derzeit in klinischen Studien, und die Zahl steigt schnell. In Entwicklung von ADCs, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit zu maximieren und die Nebenwirkungen zu minimieren. Unter diesen Faktoren eine effiziente und stellenspezifische Konjugationsreaktion zu einer kovalenten Bindung zwischen einem Antikörper bilden, und ein Medikament ist kritisch. Die gewünschte Effizienz und Spezifität in der Konjugationsreaktion kann in eine durch Konjugation mit einem bioorthogonale funktionelle Gruppe erreicht werden,unnatürliche Aminosäure, die in einem Antikörper, der spezifisch eingeschlossen ist. Hier ^22-26 berichten wir über ein Protokoll zur ortsspezifisch integrieren AF in einem Antikörper-Fragment und konjugieren das mutierte Antikörperfragment mit einer biochemischen Sonde.

Protokoll

1. Plasmidkonstruktion

1. Konstruieren eines Expressionsplasmids (pBAD-HerFab-L177TAG) , die das Ziel - Antikörper - Gen (pBAD-HerFab-WT) mit einem His ₆ -tag zum Ausdruck bringen würde, und ersetzen Sie das Codon für Leucin-177 mit dem Amber - Codon (TAG) ^27, unter Verwendung von herkömmliche ortsspezifische Mutagenese-Technik.
   Siehe Tabelle der Materialien.
2. Konstruieren Sie ein anderes Expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) , um die Gene für die entwickelte tRNA ^Tyr und Aminoacyl-tRNA - Synthetase (aaRS) Paar enthält. Verwenden Sie die speziell entwickelten Plasmidvektor, pEVOL, für einen effizienten Einbau von UAAs. Die detaillierten Informationen Plasmid und das Klonen Protokolle werden im vorherigen Bericht beschrieben. ²⁸
3. Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA durch kommerziell erhältliche Plasmid Vorbereitungs-Kits verwenden. Das 260/280 Verhältnis von ~ 1,8 ist optimal für die gereinigte DNA. Bei Bedarf durchführen 1% Agarose-Gelelektrophorese, die Reinheit der DNA zu überprüfen.

2. Kultur Vorbereitung

1. Elektroporation
   1. Fügen Sie jede 1 & mgr; l DNA von pEVOL-AFRS ²⁸ und pBAD-HerFab-L177TAG bis 20 & mgr; l Escherichia coli DH10β Stamm. Vorsichtig mischen, mit einer Pipette. Die Plasmide können zusammen oder in unabhängigen Reaktionen umgewandelt werden.
   2. Für 0,1 cm Küvetten, stellen Sie die Elektroporation Einstellungen bis 25 uF und 2,5 kV.
   3. Setzen Sie die Küvette in die Folie von der schockierenden Kammer. Schieben Sie den Schlitten in die Kammer, bis die Küvette einen festen Kontakt mit den Kammerelektroden macht.
   4. Pulse einmal durch den Puls-Taste, bis die Elektroporation Gerät einen Signalton drücken.
   5. 1 ml SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium , enthaltend 2% (w / v) Trypton, 0,5% (w / v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl ₂ und 20 mM Glucose in die Küvette um die Mischung in ein Reagenzglas schnell und übertragen. Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C unter Schütteln.
   6. Spread transformierte E. coli - Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , die entsprechenden Antibiotika (35 ug / ml Chloramphenicol und 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion pEVOL-AFRS und pBAD-HerFab-L177TAG, respectively). Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 12 h.
2. Kultur Vorbereitung
   1. Impfen eine einzelne transformierte Kolonie in 5 ml LB-Medium mit Antibiotika. Inkubieren für 12 h bei 37 ° C unter Schütteln.

3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF

1. Die Expression von HerFab-L177AF
   1. Übertragung der Primärkultur (5 ml) in 200 ml LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) und AF (1 mM), gefolgt von Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln.
      HINWEIS: 100 mM AF-Stammlösung (10 ml) wurde durch Auflösen von 206 mg AF in 100 mM Salzsäure (10 ml, Endvolumen) hergestellt.
   2. In 2 ml 1,6 M Arabinose (16mM Endkonzentration) , wenn die Kultur der log-Phase erreicht (OD ₅₅₀ = 0,8, OD = optische Dichte). Inkubieren für 12 h bei 30 ° C unter Schütteln.
   3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen und gefrier das Pellet bei -20 ° C.
2. Zelllyse
   1. die Mischung 1 h bei 37 ° C Resuspendieren der Zellpellets in 20 ml Puffer periplasmatischen Lyse, enthaltend 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% Sucrose und 0,2 mg / ml Lysozym und inkubieren.
   2. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen und verwerfen das Pellet.
3. Ni-NTA - Affinitätschromatographie
   1. Hinzufügen Ni-NTA-Harz Suspension zu jedem Zentrifugenröhrchen (400 & mgr; l Harz für eine 200 ml-Kultur) und vorsichtig mischen bei 4 ° C für 1 h.
   2. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und wäscht das Harz dreimal mit 5 ml Wasch buffer enthaltend 50 mM NaH ₂ PO ₄ (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
   3. Eluieren des Zielantikörpers mit 300 & mgr; l Elutionspuffer, der 50 mM NaH ₂ PO ₄ (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
   4. Bestimmen Konzentration des mutierten Proteins durch Bradford-Test ²⁹ oder durch die Absorption bei 280 nm gemessen wird . Berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten (75.866 M ^-1 cm ^-1) für HerFab-L177AF bei 280 nm durch Protein - Extinktionskoeffizient Rechner unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten (2471 M ^-1 cm ^-1) für AF.
      HINWEIS: Die Aminosäuresequenz von HerFab kann in der NCBI-Website (: 783.282.791 und GI: 783282792 GI) zu finden.

4. Konjugation von Purified HerFab-L177AF mit Alkin-Sonden mit Dehnungs geförderten Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC)

1. Geben Sie 20 & mgr; l Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) in H ₂ O (20081; M Endkonzentration) wurde zu einer Lösung von 10 & mgr; l-HerFab L177AF (10 uM Endkonzentration) in Phosphatpuffer 10 mM Na ₂ HPO ₄ (pH 7,0) und 100 mM NaCl enthält.
   HINWEIS: Als Alternativen difluoriert Cyclooctin (DIFO) und Bicyclo [6.1.0] Nonin (BCN) Derivate sind für die gleiche Anwendung ebenfalls zur Verfügung.
2. Lassen Sie die dehnungs gefördert Cycloadditionsreaktion für 6 h bei 37 ° C fortzufahren. Wenn eine lichtempfindliche Sonde (zB Cy5.5) verwendet wird, umfassen das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie.
3. Man reinige den markierten HerFab gemäß Schritt 5.

5. Reinigung von Beschriftete HerFab

1. Fügen 500 ul Probe einem Zentrifugalfilter Spinsäule.
2. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 14.000 × g bei 4 ° C für 15 min.
3. Durchfluss verwerfen und Transferprobe aus dem Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gereinigt.
4. Als Alternative 5.1- 5.3 zu Schritt, führen Purification durch Dialyse gegen den gleichen Puffer.
5. Lagern Sie die gereinigte markierte HerFab bei 4 ° C.

6. SDS-PAGE-Analyse von Beschriftete HerFab

1. Werden 5 & mgr; l LDS Proteinprobenpuffer mit 106 mM Tris · HCl, 141 mM Tris-Base (pH 8,5), 2% LDS, 10% Glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blau G250 und 0,175 mM Phenolrot bis 13 & mgr; l (-) von 2 & mgr; l Dithiothreitol (DTT, 100 mM Endkonzentration) HerFab (7,8 uM bzw. 0,38 mg / ml) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit markierter gereinigt. Inkubieren der Mischung bei 95 ° C für 10 min.
2. Bringen Sie die 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE-Gel-Kassette in die Elektrophorese-Zelle und fügen Puffer läuft. Laden Sie die konjugierte Proteinproben und die vorgefärbten Molekulargewichtsmarker. Führen Gelelektrophorese für 35 min bei 200 V.
   Hinweis: Halten Sie die Elektrophorese-Zelle im Dunkeln während des gesamten Zeitraums Photobleaching des Fluorophors zu minimieren.
3. Nach der Elektrophorese übertragendas Gel mit einem Fluoreszenz-Gel-Scanners und Scannen für die Fluoreszenzemission bei der entsprechenden Wellenlänge. Für Cy5.5, verwenden Sie die Cy5-Modus in der Scanner-Software.
4. Beflecken das Gel mit einem handelsüblichen Proteinfleck.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde ein Antikörperfragment ortsspezifisch mit einem Fluorophor konjugiert durch ein Azid enthaltenden Aminosäure in dem Fragment enthält , und das mutante Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctin Umsetzung von (Abbildung 1). HerFab wurde als Zielantikörperfragment ausgewählt ist, in die AF als Azid-enthaltende Aminosäure eingebaut wurde. Zu dem Rückstand in HerFab für den Ersatz mit AF, die Röntgenkristallstruktur von HerFab w...

Diskussion

Die genetische Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine ​​hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Proteinmodifikation verwendet. ^1-3 Einer der wichtigen Vorteile ist die allgemeine Anwendbarkeit auf jede Art von Protein. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für ein Zielprotein und eine Zielstelle des Proteins in der Auswahl. Jedoch Ersetzen eines strukturell oder funktionell wichtigen Rückstand mit einem UAA resultieren, die die Struktur und Funktion des Zielproteins in verändern. Im...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG			Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS			Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Ethidium bromide	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium	Wako	018-10372	25 g
Chloramphenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)	Bachem	F-3075.0001	1 g
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Hydrochloric acid, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%	SAMCHUN	E0064	1 kg
Sucrose	Sigma	S9378	500 g
Lysozyme	Siyaku	126-0671	1 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	25 mL
Polypropylene column	QIAGEN	34924	50/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%	SAMCHUN	I0578	1 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Sodium Chloride, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	MILLIPORE	UFC500396	96/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels	Thermofisher	NO0321	12-well
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
Typhoon 9210 variable mode imager	Amersham Biosciences