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요약

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

초록

그들의 구조와 기능을 연구하는 단백질로 화학 프로브를 소개 할 수 현재 많은 화학 도구가 있습니다. 유용한 방법은 유 전적으로 bioorthogonal 관능기를 함유하는 천연 아미노산을 도입하여 단백질 결합이다. 이 보고서는 사이트 별 항체 결합에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 아 지드 - 함유 아미노산의 유전자 도입하고, 변형 촉진 지드 - 사이클로 알킨 (SPAAC)에 의한 접합 반응의 실험 세부 사항을 포함한다. 이 변형 촉진 반응은 생리적 pH와 온도에서 반응 분자의 단순한 혼합으로 진행하고, 구리 (I) 이온 및 구리 킬레이트 배위자와 같은 추가의 시약을 필요로하지 않는다. 따라서,이 방법은 일반적으로 단백질 결합 항체 약물 접합체 (ADC)는 개발에 유용 할 것입니다.

서문

대장균에서 P는 -methoxyphenylalanine의 유전 적 결합이보고 된 이후, 한 100 개 이상의 비 천연 아미노산 (UAAs가) 성공적으로 다양한 단백질에 통합되었습니다. 이들 중에서도 UAAs 1-3 bioorthogonal 관능기를 함유하는 아미노산은 광범위하게 연구하고, 최대 비율을 표현하고있다. UAAs에 사용되는 bioorthogonal 기능 그룹은 케톤, 4 지드, 5 알킨, 6 cyclooctyne, 7 테트라, 8 α, β 불포화 아미드, 9 노보 넨, 10 transcyclooctene, 11, 시클로 [6.1.0] -nonyne을 포함한다. 각 작용기는 장점과 단점이 있지만 (11), 아 지드 - 함유 아미노산이 가장 광범위 단백질 접합에 사용되어왔다. P -Azidophenylalanine (AF), 아지도 - 함유 아미노산 중 하나가 용이 가능하며, 그 혼입 efficiency이 우수합니다. 이 아미노산을 함유하는 변이체 단백질은 구리 촉매 고리 화하거나 SPAAC 의해 cyclooctynes ​​알킨과 반응 할 수있다. 12-20

최근 바이오 제약 산업에서 큰 관심을 받고있다. 항체 약물 접합체 (ADC)는 의한 인간 암 (21) 및 치료 대상 치료 능력에 유리한 치료 항체의 클래스 기타 질병. 50 개 이상의 ADC는 임상 시험에서 현재 및 수는 급속히 증가하고있다. ADC 제품 개발에 많은 요인 효과를 최대화하고 부작용을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 이러한 요인 중 효율적이고 부위 특이 적 결합 반응은 항체와 공유 결합을 형성하고, 약물은 매우 중요하다. 공액 반응에 원하는 효율 및 특이성은 bioorthogonal에서 작용기와 결합함으로써 달성 될 수있다특이 항체로 혼입되는 비 천연 아미노산. 여기에 22 ~ 26, 우리에 대한 프로토콜을보고 사이트를-구체적으로 통합 항체 단편으로 AF 및 생화학 프로브 변이체 항체 단편 공역.

프로토콜

1. 플라스미드 건설

  1. 그의 6 -tag와 대상 항체 유전자 (pBAD-HerFab-WT)을 표현하는 것 발현 플라스미드 (pBAD-HerFab - L177TAG)를 구축하고, 앰버 코돈과 류신-177의 코돈을 대체 (TAG) 27 사용 종래의 부위 특이 적 변이 법.
    재료의 표를 참조하십시오.
  2. 진화의 tRNA 티르와 아미노 아실 tRNA의 합성 (Aars의) 한 쌍의 유전자를 포함하는 또 다른 발현 플라스미드 (pEVOL-AFRS)를 구축합니다. UAAs의 효율적인 통합을 위해 특별히 디자인 된 플라스미드 벡터, pEVOL을 사용합니다. 상세한 정보 및 플라스미드 복제 프로토콜은 이전 보고서에 기재되어있다. (28)
  3. 시중에서 판매하는 플라스미드 준비 키트를 사용하여 높은 품질의 플라스미드 DNA를 얻습니다. ~ 1.8의 280 분의 260 비율은 정제 된 DNA에 최적입니다. 필요한 경우, DNA의 순도를 확인하는 1 % 아가 로스 겔 전기 영동을 수행한다.

2. 문화 준비

  1. 전기
    1. 20 μL 대장균 DH10β 균주에 pEVOL-AFRS 28 pBAD-HerFab - L177TAG 각각 1 μL의 DNA를 추가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 플라스미드를 함께 또는 독립적 인 반응으로 변형 될 수있다.
    2. 0.1 cm 큐벳를 들어, 25 μF 2.5 kV의에 전기 설정을 설정합니다.
    3. 충격적인 챔버의 슬라이드에 큐벳을 삽입합니다. 큐벳 챔버 전극에 닿을 때까지 챔버로 슬라이드를 밀어 넣습니다.
    4. 일렉트로 기계 경고음까지 펄스 버튼을 눌러 한 번 펄스.
    5. catabolite 억압 (SOC) 배지, 효모 추출물, 10 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을 (/ V W) 트립 톤, 0.5 % (/ V W), 10 밀리미터의 MgCl 2, 2 %를 함유하는 1 ㎖의 슈퍼 최적 국물, 20 mM의 글루코스를 추가 신속 큐벳 및 테스트 튜브에 혼합물을 옮긴다. 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 세포를 인큐베이션.
    6. (pEVOL-AFRS 각각 pBAD-HerFab - L177TAG을 선택하기위한 35 μg의 / ML의 클로람페니콜과 100 μg의 / ML의 암피실린) 적절한 항생제를 포함하는 판 한천 원성 국물 (LB)의 확산 형질 전환 된 대장균 세포. 12 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  2. 문화의 준비
    1. 5 ㎖ LB 배지 포함하는 항생제의 단일 변환 식민지의 예방. 진탕 37 ° C에서 12 시간 동안 품어.

3. 발현 및 HerFab-L177AF의 정제

  1. HerFab - L177AF의 발현
    1. 200 mL의 LB 배지에 암피실린을 함유하는 일차 배양 (5 ml)에 전송 (100 μg의 / mL) 및 AF (1 mM)을 진탕하면서 37 ℃에서 배양 하였다.
      주 : 100 mM의 AF 스톡 용액 (10 ㎖)을 100 mM의 염산 (10 ㎖, 최종 부피)을 206 mg의 AF를 용해시켜 제조 하였다.
    2. (16 1.6 M 아라비 노스의 2 mL를 넣고문화 로그 상 (OD 550 = 0.8, OD = 광학 밀도)에 도달 mM의 최종 농도). 진탕 30 ° C에서 12 시간 동안 품어.
    3. 5 분 동안 11,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 펠렛을 동결.
  2. 세포 용해
    1. 30 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 20 % 수 크로스, 0.2 ㎎ / ㎖의 리소자임을 함유하는 20 ㎖ 세포질 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 37 ° C에서 1 시간 동안 혼합물을 배양한다.
    2. 15 분 동안 4 ℃에서 18,000 × g으로의 세포 용 해물을 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
  3. 니켈 NTA 친 화성 크로마토 그래피
    1. 각각의 원심 분리기 튜브 (200 mL의 문화 400 μL 수지)에 니켈 NTA 수지 서스펜션을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 부드럽게 섞는다.
    2. 폴리 프로필렌 열로 현탁액을 붓고 5 mL로 세척 버퍼와 수지 세 번 씻어ffer의 50 mM의 NaH 2 PO 4 (PH 8.0), 20 mM의 이미 다졸, 및 300 mM의 NaCl을 함유하는.
    3. 50 밀리미터에 NaH 2 PO 4 (PH 8.0), 250 mM의 이미 다졸, 및 300 mM의 NaCl을 함유하는 300 μL 용출 완충액 표적 항체를 용출시켰다.
    4. 브래드 포드 단백질 분석 (29)에 의해 또는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 돌연변이 단백질의 농도를 결정합니다. 흡광 계수 (2471 M -1 cm-1)에 대한 AF를 사용하여 단백질 흡광 계수 산출하여 280 nm에서 HerFab-L177AF 대한 흡광 계수 (75,866 M -1 cm-1)를 계산한다.
      주 : HerFab의 아미노산 서열은 NCBI 웹 사이트에서 발견 (GI : 783282791 및 GI : 783282792)을 할 수있다.

스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로을 사용하여 알킨 프로브를 정화 HerFab-L177AF 4. 활용 (SPAAC)

  1. (H 2 O에 200 Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) 20 μL를 추가81, 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 (pH 7.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 인산염 완충액 HerFab-L177AF 10 μL (10 μM 최종 농도)의 용액에 M, 최종 농도).
    참고 : 대안, 다이 플루오르 cyclooctyne (DIFO) 및 시클로 [6.1.0] nonyne (BCN) 파생 상품은 같은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.
  2. 스트레인 승진 고리 화 반응은 37 ℃에서 6 시간 동안 진행 할 수 있습니다. 감광성 프로브 (예, Cy5.5)를 사용하는 경우, 알루미늄 박과의 반응 용기 커버.
  3. 5 단계에 따라 표시 HerFab을 정화.

레이블이 HerFab 5. 정제

  1. 원심 필터 스핀 컬럼에 시료 500 μL를 추가합니다.
  2. 15 분 동안 4 ° C에서 14,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기.
  3. 폐기 관류 및 전송에 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 스핀 컬럼으로부터 샘플을 정제 하였다.
  4. 대안 5.1 5.3 단계로서, 정수기를 수행동일한 완충액에 대해 투석하여 기.
  5. 4 ° C에서 정제 된 라벨 HerFab를 저장합니다.

레이블이 HerFab 6. SDS-PAGE 분석

  1. 106 mM 트리스 · 염산, 141 mM 트리스베이스 (PH 8.5), 2 % LDS, 10 % 글리세롤, 0.51 mM의 EDTA, 0.22 밀리미터의 Serva 블루 G250, 그리고 13 μL에 빨간색 0.175 mM의 페놀을 포함하는 5 μL LDS 단백질 샘플 버퍼를 추가 존재 (+) 또는 부재 HerFab (7.8 μM 또는 0.38 ㎎ / ㎖)을 표지 된 정제 된 (-) 2 μL 디티 오 트레이 톨 (DTT, 100 mM의 최종 농도). 10 분 동안 95 ℃에서 혼합물을 인큐베이션.
  2. 전기 영동 셀에 4-12% 비스 - 트리스 SDS-PAGE 겔 카세트를 부착하고 버퍼를 실행에 추가합니다. 공액 단백질 샘플 및 사전 스테인드 분자량 마커를로드합니다. 200 V. 35 분간 전기 영동을 수행
    참고 : 형광의 사진 표백을 최소화하기 위해 전체 기간 동안 어둠 속에서 전기 영동 셀을 유지합니다.
  3. 전기 영동 후, 전송형광 젤 스캐너에 젤, 그리고 적절한 파장에서 형광 방출을 검색. Cy5.5 들어 스캐너 소프트웨어에서 Cy5의 모드를 사용한다.
  4. 상업 단백질 얼룩 젤을 얼룩.

결과

이 연구에서, 항체 단편은 부위 - 특이 적 단편에 아 지드 - 함유 아미노산을 도입하고, 변형 cyclooctyne로 돌연변이 된 항체 단편을 반응시켜 형광 물질과 결합 (도 1)이었다. HerFab은 AF가 지드 - 함유 아미노산으로 통합되었다하는 대상 항체 단편으로서 선택 하였다. AF로 교체 HerFab 잔사를 선택하려면 HerFab의 X 선 결정 구조 분석 하였다. 잔류 물을 30 ...

토론

단백질에 비 천연 아미노산의 유전 결합 단백질 변성에 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 중요한 장점 중 1-3 하나는 단백질의 종류는 일반적으로 적용됩니다. 원칙적으로, 표적 단백질 및 단백질의 표적 부위를 선택에는 제한이 없다. 그러나 UAA와 구조적 또는 기능적으로 중요한 잔기의 치환은 목적 단백질의 구조와 기능을 변화 될 수있다. 일반적으로, 용매에 노출되...

공개

The authors have nothing to disclose.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAGOptionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulserBIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SucroseSigmaS9378500 g
LysozymeSiyaku126-06711 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4xThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112-well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 variable mode imagerAmersham Biosciences

참고문헌

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