JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Abstract

כרגע יש הרבה כלים כימיים זמינים להציג בדיקות כימיות לחלבונים ללמוד המבנה והתפקוד שלהם. שיטה יעילה היא הצמידה חלבון על ידי החדרה גנטית חומצת אמינו טבעית המכילה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. דו"ח זה מתאר פרוטוקול מפורט נטיית נוגדן אתר ספציפי. הפרוטוקול כולל פרטים ניסיוניים עבור שילוב הגנטי של חומצה תזיד המכיל אמינו, ותגובת הנטייה ידי cycloaddition אלקין-יזיד קדם-זן (SPAAC). התגובה זן-קידם זה ממשיך ידי ערבוב פשוט של מולקולות מגיבים ב- pH וטמפרטורה פיזיולוגיים, ואינו דורש ריאגנטים נוספים כגון יוני נחושת (אני) ו ligands chelating-נחושת. לכן, שיטה זו תהיה שימושית עבור נטיית חלבון בכלל ופיתוח של conjugates תרופת הנוגדן (ADC).

Introduction

מאז ההתאגדות הגנטית של -methoxyphenylalanine p ב Escherichia coli נמסרה, 1 יותר מ -100 חומצות אמינו לא טבעיות (UAAs) שולבו בהצלחה לחלבונים שונים. 1-3 בין UAAs אלה, חומצות אמינו המכילות קבוצות פונקציונליות bioorthogonal נחקרו רבות ומייצגים את השיעור הגבוה ביותר. הקבוצות הפונקציונליות bioorthogonal המשמשים UAAs כוללים קטון, 4 אזיד, 5 אלקין, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β אמיד-בלתי רוויות, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 ו bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 למרות כל קבוצה פונקציונלית יש יתרונות וחסרונות, חומצות אמינו המכיל תזדנה שמשו בצורה המקיפה ביותר עבור נטיית חלבון. p -Azidophenylalanine (AF), אחת מחומצות אמינו המכיל azido, זמין, ו effic התאגדותהiency מצוין. חלבונים Mutant המכיל חומצת אמינו זו ניתן הגיבו עם alkynes ידי cycloaddition היה הזרז נחושת או עם cyclooctynes ​​ידי SPAAC. 12-20

לאחרונה, תרופות ביולוגיות היו למשוך תשומת לב רבה בתעשיית התרופות. המצומד נוגדן-תרופה (ADC) היא מחלקה של נוגדנים הטיפוליות הקיימות יתרון בשל יכולתם לטיפול ממוקד לטיפול בגידולים בבני אדם 21 מחלות אחרות. יותר מ -50 ADCs כרגע בניסויים קליניים, והמספר גדל במהירות. בפיתוח של ממירי ADC, גורמים רבים צריכים להילקח בחשבון על מנת למקסם את היעילות ולצמצם את תופעות הלוואי. בין גורמים אלה, תגובת נטייה יעילה באתר ספציפי כדי ליצור קשר קוולנטי בין נוגדן ותרופה היא קריטית. היעילות הרצויה וספציפי תגובת הנטייה יכולים להיות מושגת על ידי נטייה עם קבוצה פונקציונלית bioorthogonal בביתחומצת אמינו טבעית אשר משולבת באופן ספציפי נוגדן. הנה 22-26, אנו מדווחים פרוטוקול אתר ספציפי לשלב AF לתוך נוגדן ו להטות שבר נוגדנים מוטציה עם בדיקה ביוכימית.

Protocol

1. בניית פלסמיד

  1. לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-HerFab-L177TAG) שיבטא את הגן נוגדן היעד (pBAD-HerFab-WT) עם -tag 6 שלו, ולהחליף את קודון עבור לאוצין-177 עם קודון ענבר (TAG) 27, באמצעות טכניקת mutagenesis אתר מכוון קונבנציונלית.
    ראה טבלה של חומרים.
  2. לבנות עוד פלסמיד ביטוי (pEVOL-AFRS) המכיל את הגנים עבור Tyr tRNA התפתחו synthetase aminoacyl-tRNA (המפיצים המורשים) זוג. השתמש וקטור הפלסמיד והמעוצב, pEVOL, עבור התאגדות יעילה של UAAs. פרוטוקולי מידע שיבוט פלסמיד המפורטים מתוארים בדוח הקודם. 28
  3. השג פלסמיד דנ"א באיכות גבוהה באמצעות הכנת ערכות פלסמיד זמינות מסחרי. יחס 260/280 של ~ 1.8 הוא אופטימלי עבור ה- DNA המטוהר. במידת הצורך, לבצע 1% ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לבדוק את הטוהר של ה- DNA.

s = "jove_title"> 2. הכנת תרבות

  1. electroporation
    1. הוסף כל DNA 1 μL של pEVOL-AFRS 28 ו pBAD-HerFab-L177TAG 20 זן μL Escherichia coli DH10β. מערבבים בעדינות, בעזרת פיפטה. פלסמידים יכול להיות המועברים ביחד או בתגובות עצמאיות.
    2. לקבלת cuvettes 0.1 ס"מ, לקבוע את הגדרות electroporation 25 μF ו -2.5 קילו.
    3. הכנס את קובט לתוך השקופיות של החדר המזעזע. דחוף את השקופית לתוך התא עד קובט יוצר קשר עם משרד האלקטרודות הקאמרי.
    4. Pulse פעם על ידי לחיצה על כפתור הדופק עד יצפצף electroporation.
    5. הוסף 1 מ"ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני המכיל 2% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 KCl מ"מ, 10 מ"מ MgCl 2, ו -20 גלוקוז מ"מ כדי קובט במהירות ולהעביר את התערובת לתוך מבחנה. דגירת התאים עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
    6. מורחים טרנספורמציה E. coli תאים על מרק Lysogeny (LB) אגר צלחות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (35 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol ו -100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין לבחירת pEVOL-AFRS ו pBAD-HerFab-L177TAG, בהתאמה). דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
  2. הכנה תרבות
    1. לחסן מושבה טרנספורמציה אחת 5 אנטיביוטיקה המכיל בינוני מ"ל LB. דגירה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.

ביטוי טיהור 3. HerFab-L177AF

  1. הביטוי של HerFab-L177AF
    1. מעבירים את התרבות העיקרי (5 מ"ל) לתוך 200 אמפיצילין המכיל בינוני מ"ל LB (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו AF (1 מ"מ), ואחריו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      הערה: 100 מ"מ AF פתרון המניות (10 מ"ל) הוכנה על ידי המסת 206 מ"ג AF ב 100 מ"מ חומצה הידרוכלורית (10 מ"ל, נפח סופי).
    2. הוסף 2 מ"ל של 1.6 M arabinose (16לריכוז סופי מ"מ) כאשר התרבות מגיע ביומן פאזיים (OD 550 = 0.8, OD = צפיפות אופטית). דגירה במשך 12 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד.
    3. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ולהקפיא גלולה ב -20 ° C.
  2. תמוגה Cell
    1. Resuspend את כדורי תא 20 חיץ מ"ל periplasmic תמוגה המכיל 30 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 20% סוכרוז ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​ליזוזים, דגירה את התערובת במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. צנטריפוגה lysate התא 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעביר את supernatant לצינור טרי וזורק את הכדור.
  3. כרומטוגרפיה זיקה Ni-נ.ת.ע
    1. הוסף ההשעיה שרף Ni-נ.ת.ע לכל צינור צנטריפוגות (שרף 400 μL עבור תרבות מ"ל 200), ומערבבים בעדינות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן ולשטוף את שרף שלוש פעמים עם 5 bu לשטוף מ"לffer המכיל 50 מ"מ לאא 2 PO 4 (pH 8.0), 20 מ"מ imidazole, ו -300 מ"מ NaCl.
    3. Elute הנוגדן היעד עם חיץ elution 300 μL המכיל 50 מ"מ לאא 2 4 PO (8.0 pH), 250 imidazole מ"מ, ו -300 מ"מ NaCl.
    4. קביעת ריכוז של חלבון מוטנטי ידי השיטה ברדפורד 29 או על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. חשב את מקדם הכחדה (75,866 M -1 cm -1) עבור HerFab-L177AF ב 280 ננומטר על ידי מחשבון מקדם הכחדה חלבון באמצעות מקדם הכחדה (2471 M -1 cm -1) עבור AF.
      הערה: את רצף החומצות האמיניות של HerFab ניתן למצוא באתר צמח השדה (GI: 783,282,791 ו GI: 783,282,792).

4. הצמידה של מטוהרי HerFab-L177AF עם בדיקות אלקין שימוש קדם-זנים יזיד-אלקין cycloaddition (SPAAC)

  1. הוסף 20 μL של Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) ב H 2 O (20081; לריכוז סופי M) לפתרון של 10 μL של HerFab-L177AF (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) במאגר פוספט המכיל 10 מ"מ Na 2 HPO 4 (pH 7.0) ו 100 mM NaCl.
    הערה: ככל חלופות, difluorinated cyclooctyne (DIFO) ו bicyclo [6.1.0] nonyne (BCN) נגזרים זמינים גם עבור אותו יישום.
  2. אפשר תגובת cycloaddition קדם-הזן להמשיך במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. אם בדיקה רגישה לאור (למשל, Cy5.5) משמשת, מכסה את כלי התגובה ברדיד אלומיניום.
  3. לטהר את HerFab סומן על פי שלב 5.

5. טיהור תווית HerFab

  1. הוספת 500 μL של המדגם לעמודה ספין מסנן צנטריפוגלי.
  2. צנטריפוגה העמודה ספין על 14,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  3. מחק זרימה דרך העברת מטוהרים מדגם מהעמודה ספין כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  4. כחלופה לשלב 5.3 5.1-, לבצע purification ידי דיאליזה נגד אותו החיץ.
  5. אחסן את HerFab שכותרתו מטוהר על 4 מעלות צלזיוס.

6. SDS-PAGE ניתוח של תווית HerFab

  1. הוסף 5 חיץ מדגם חלבון μL LDS המכיל 106 מ"מ טריס · HCl, 141 בסיס טריס מ"מ (pH 8.5), 2% LDS, 10% גליצרול, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ"מ Serva כחול G250, ו 0.175 מ"מ פנול אדום עד 13 μL של מטוהרים שכותרתו HerFab (7.8 מיקרומטר או 0.38 מ"ג / מ"ל) בנוכחות (+) או העדרה (-) של 2 μL dithiothreitol (DTT, 100 מ"מ הריכוז הסופי). דגירה את התערובת על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. צרף את הקלטת ג'ל 4-12% Bis-טריס SDS-PAGE לתא אלקטרופורזה ולהוסיף הפעלת המאגר. טען את דגימות חלבון מצומדות ואת סמן משקל מולקולרי מראש מוכתם. בצע ג'ל אלקטרופורזה במשך 35 דקות ב 200 V.
    הערה: שמור את תא אלקטרופורזה בחושך במשך כל תקופת למזער צילום הלבנה של fluorophore.
  3. לאחר אלקטרופורזה, להעבירהג'ל סורק ג'ל ניאון, ולסרוק עבור פליטת קרינה באורך הגל המתאים. לקבלת Cy5.5, להשתמש במצב Cy5 בתוכנת הסורק.
  4. כתם ג'ל עם כתם חלבון מסחרי.

תוצאות

במחקר זה, מקטע נוגדן היה האתר ספציפי מצומדות עם fluorophore על ידי שילוב של חומצות אמיניות המכילים תזדנה לתוך שהבר ותגובת שבר נוגדני המוטציה עם cyclooctyne מתוח (איור 1). HerFab נבחרה נוגדן היעד שלתוכו AF התאגד חומצת אמינו תזיד המכיל. כדי לבחור את שאריות...

Discussion

השילוב הגנטי של חומצות אמינו לא טבעיות לחלבונים יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות משמשות שינוי חלבון. 1-3 אחד היתרונות החשובים הוא התחולה הכללית שלה לכל סוג של חלבון. באופן עקרוני, אין הגבלה בבחירת חלבון מטרה ואתר היעד של החלבון. עם זאת, החלפת משקע מבני או תפקודי ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAGOptionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulserBIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SucroseSigmaS9378500 g
LysozymeSiyaku126-06711 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4xThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112-well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 variable mode imagerAmersham Biosciences

References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118cycloaddition

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved