JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Аннотация

Есть в настоящее время многие химические инструменты, доступные для введения химических зондов в белки, чтобы изучить их структуру и функцию. Полезный метод белка конъюгации с помощью методов генной введением искусственную аминокислоту, содержащую bioorthogonal функциональную группу. В настоящем докладе описывается подробный протокол для сайт-специфической конъюгации антитела. Протокол включает экспериментальные данные для генетического включения азида, содержащего аминокислоты, а также реакции конъюгации штаммом раскрученной азид-алкиновая циклоприсоединения (SPAAC). Этот штамм раскрученной реакция протекает путем простого смешивания реагирующих молекул при физиологическом рН и температуры, а также не требует дополнительных реагентов, таких как медь (I) и ионов меди хелатирующих лигандов. Таким образом, этот метод был бы полезен для общего конъюгации белка и развития Конъюгаты антител с наркотиками (АЦП).

Введение

Поскольку генетическое включение р -methoxyphenylalanine в кишечной палочки сообщалось, 1 более 100 ненатуральные аминокислоты (УААН) были успешно включены в различные белки. 1-3 Среди этих УААН, аминокислоты , содержащие bioorthogonal функциональные группы были тщательно изучены и представляют собой самую большую долю. В bioorthogonal функциональные группы , используемые в UAAS включают кетон, 4, 5 азид алкина, 6, 7 cyclooctyne тетразин, 8 a, b-ненасыщенного амида, 9, 10 norbonene transcyclooctene, 11 и бицикло [6.1.0] -nonyne. 11 Хотя каждая функциональная группа имеет свои преимущества и недостатки, азида содержащих аминокислоты наиболее широко используются для белка сопряжения. р -Azidophenylalanine (АФ), один из азидо , содержащих аминокислоты, легко доступен, и его введение efficiency отлично. Мутантные белки, содержащие эту аминокислоту можно вводить в реакцию с медью алкинов, катализируемых циклоприсоединения или с cyclooctynes ​​по SPAAC. 12-20

В последнее время биофармацевтических привлекают большое внимание в фармацевтической промышленности. Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) , является класс терапевтических антител, которые выгодно из - за их способности к целенаправленной терапии для лечения рака у человека 21 и других заболеваний. Более 50 АЦП в настоящее время в клинических испытаниях, и их число быстро растет. В разработке АЦП, многие факторы необходимо учитывать, чтобы максимизировать эффективность и свести к минимуму побочные эффекты. Среди этих факторов, эффективный и сайт-специфической реакции конъюгации с образованием ковалентной связи между антителом и лекарственное средство имеет решающее значение. Требуемая эффективность и специфичность в реакции конъюгации может быть достигнуто путем конъюгации с bioorthogonal функциональной группой вискусственную аминокислоту, которая специфически включена в антитело. 22-26 Здесь мы сообщаем протокол к сайту, в частности , включают АФ в фрагмента антитела и сопряжем фрагмент мутантного антитела с биохимической зондом.

протокол

1. Плазмиду Строительство

  1. Построить выражение плазмиды (pBAD-HerFab-L177TAG) , которая выражала бы ген целевого антитела (pBAD-HerFab-WT) с его 6 в тег, и заменить кодон лейцина-177 с янтарным кодона (TAG) 27, с использованием обычный сайт-направленный мутагенез метод.
    Таблицу материалов.
  2. Построить еще одно выражение плазмиды (pEVOL-AFRs) , содержащий гены проэволюционировавшего тРНК Тир и аминоацил-тРНК - синтетазы пары (AARS). Используйте специально разработанные плазмиды вектор, pEVOL, для эффективного включения УААН. Подробные плазмида информационные и клонированию протоколы описаны в предыдущем сообщении. 28
  3. Получение плазмидной ДНК высокого качества с использованием коммерчески доступных наборов препарата плазмидной. Отношение ~ 1,8 260/280 является оптимальной для очищенной ДНК. При необходимости, выполнить 1% агарозном геле с целью проверки чистоты ДНК.

2. Культура Подготовка

  1. Электропорация
    1. Добавьте каждый 1 мкл ДНК pEVOL-AFRs 28 и pBAD-HerFab-L177TAG до 20 мкл кишечной палочки штамма DH10β. Осторожно перемешать, с помощью пипетки. Плазмиды могут быть трансформированы совместно или в независимых реакций.
    2. Для 0,1 см кюветах, установить параметры электропорации до 25 мкФ и 2,5 кВ.
    3. Вставьте кювету в скольжении шокирующей камеры. Вставьте слайд в камеру, пока кювета не имеет плотного контакта с электродами камеры.
    4. Pulse один раз, нажимая на кнопку импульсного режима до электропорации сигналов аппарата.
    5. Добавить 1 мл супер оптимальный бульон с катаболитной репрессии (СОК) среды , содержащей 2% (вес / объем) триптона, 0,5% (вес / объем) дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы в кювету и быстро вводить смесь в пробирку. Инкубируйте клетки в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании.
    6. Spread трансформировали клетки E.coli на лизогении бульона (LB) агаром , содержащих соответствующие антибиотики (35 мкг / мл хлорамфеникола и 100 мкг / мл ампициллина для выбора pEVOL-AFRs и pBAD-HerFab-L177TAG, соответственно). Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 12 часов.
  2. подготовка Культура
    1. Инокулируйте одного преобразованного колонию в 5 мл LB-среде, содержащей антибиотики. Инкубируют в течение 12 часов при 37 ° C при встряхивании.

3. Экспрессия и очистка HerFab-L177AF

  1. Выражение HerFab-L177AF
    1. Передача первичной культуры (5 мл) в 200 мл LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и автофокусировка (1 мМ), с последующей инкубацией при 37 ° C при встряхивании.
      Примечание: 100 мМ АФ маточный раствор (10 мл) получали путем растворения 206 мг AF в 100 мМ соляной кислотой (10 мл, конечный объем).
    2. Добавляют 2 мл 1,6 М арабинозы (16конечная концентрация мМ) , когда культура достигает лог-фазы (OD 550 = 0,8, OD = оптическая плотность). Инкубируют в течение 12 ч при 30 ° C при встряхивании.
    3. Урожай клеток путем центрифугирования при 11000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и заморозить осадок при -20 ° С.
  2. лизис клеток
    1. Ресуспендируют гранул клеток в 20 мл буфера для лизиса периплазматический, содержащего 30 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 20% сахарозы и 0,2 мг / мл лизоцима, и инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 ° С.
    2. Центрифуга Клеточный лизат при 18000 х г при 4 ° С в течение 15 мин. Передача супернатант в новую пробирку и отбросить осадок.
  3. Аффинной хроматографии с Ni-NTA
    1. Добавить смолы подвеска Ni-NTA на каждую центрифужную пробирку (400 мкл смолы на 200 мл культуры), и осторожно перемешивают при температуре 4 ° С в течение 1 ч.
    2. Налейте суспензии в колонну полипропилена и промывают смолу три раза 5 мл промывных бушельffer , содержащий 50 мМ NaH 2 PO 4 (рН 8,0), 20 мМ имидазола и 300 мМ NaCl.
    3. Элюции целевого антитела по 300 мкл буфера для элюции , содержащим 50 мМ NaH 2 PO 4 (рН 8,0), 250 мМ имидазола и 300 мМ NaCl.
    4. Определить концентрацию мутантного белка с помощью анализа Брэдфорда 29 или путем измерения оптической плотности при 280 нм. Вычислить коэффициент экстинкции (75866 М -1 см -1) для HerFab-L177AF при 280 нм с помощью белка коэффициент экстинкции калькулятора с использованием коэффициента экстинкции (2,471 М -1 см -1) для AF.
      Примечание: последовательность аминокислот HerFab можно найти на сайте NCBI (GI: 783282791 и GI: 783282792).

4. Сопряжение Очищенный HerFab-L177AF с алкине Зонды Использование Strain раскрученной азид-алкиновая циклоприсоединения (SPAAC)

  1. Добавьте 20 мкл Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) в H 2 O (20081; конечная концентрация М) к раствору 10 мкл HerFab-L177AF (10 мкМ конечная концентрация) в фосфатном буфере , содержащем 10 мМ Na 2 HPO 4 (рН 7,0) и 100 мМ NaCl.
    Примечание: В качестве альтернативы, difluorinated cyclooctyne (DIFO) и бицикло [6.1.0] нонин (BCN) производные также доступны для того же приложения.
  2. Дайте штамм раскрученной реакцию циклоприсоединения проводят в течение 6 ч при 37 ° С. Если светочувствительный датчик (например, Cy5.5) используется, накройте реакционный сосуд с алюминиевой фольгой.
  3. Очищают меченого HerFab в соответствии со стадией 5.

5. Очистка меченого HerFab

  1. Добавьте 500 мкл образца к центробежному фильтр ротационную колонку.
  2. Центрифуга колонку спиновый при 14000 х г при температуре 4 ° С в течение 15 мин.
  3. Выбросить проскок и передачи очищенного образца из ротационную колонку в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  4. В качестве альтернативы этапу 5.1- 5.3, выполнить purificaции путем диализа против того же самого буфера.
  5. Хранить очищенный меченый HerFab при температуре 4 ° С.

6. SDS-PAGE анализ меченых HerFab

  1. Добавьте 5 мкл LDS образец белка буфера, содержащего 106 мМ Трис & bull; HCl, 141 мМ Трис-основание (рН 8,5), 2% LDS, 10% глицерине, 0,51 мМ ЭДТА, 0,22 мМ СЕРВА Синий G250, а красный 0,175 мМ фенол до 13 мкл очищенный меченый HerFab (7,8 мкМ или 0,38 мг / мл) в присутствии (+) или отсутствие (-) 2 мкл дитиотреитола (ДТТ, 100 мМ конечная концентрация). Выдержите смесь при температуре 95 ° С в течение 10 мин.
  2. Прикрепите 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE гель кассету в электрофорез ячейку и добавить буфер работает. Загрузите конъюгированные образцы белка и предварительно окрашенную маркер молекулярного веса. Выполните гель-электрофореза в течение 35 мин при 200 В.
    Примечание: Держите ячейку электрофорез в темноте в течение всего периода, чтобы свести к минимуму фото-отбеливание флуорофора.
  3. После электрофореза передачигель для флуоресцентного сканера гель, и сканирование для флуоресцентного излучения на соответствующей длине волны. Для Cy5.5, используйте режим Cy5 в программном обеспечении сканера.
  4. Пятно гель с коммерческим пятном белка.

Результаты

В этом исследовании, фрагмент антитела был сайт-специфически конъюгирован с флуорофором путем введения азида содержащего аминокислоты в фрагмент и взаимодействие фрагмента мутантного антитела с напряженными cyclooctyne (Рисунок 1). HerFab был выбран в качестве ф...

Обсуждение

Генетическое введение неприродных аминокислот в белки имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами, используемыми для модификации белков. 1-3 Одним из важных преимуществ является его общая применимость к любому виду белка. В принципе, нет никаких ограничений в выб...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAGOptionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulserBIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SucroseSigmaS9378500 g
LysozymeSiyaku126-06711 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781 kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4xThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112-well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 variable mode imagerAmersham Biosciences

Ссылки

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены