使用仔猪模型研究麻醉诱发的发育神经毒性（AIDN）:一种转化神经科学方法

摘要

麻醉诱导的发育神经毒性（AIDN）研究集中在啮齿动物，其不广泛适用于人类。非人灵长类动物模型更相关，但成本高昂，难以用于实验。相比之下，仔猪是一种临床相关的实用动物模型，是研究麻醉神经毒性的理想选择。

摘要

在许多情况下，特别是儿童需要手术时，麻醉是不可避免的。最近对动物的研究引起了人们的担忧，即麻醉暴露可能导致神经元凋亡，称为麻醉诱导的发育神经毒性（AIDN）。此外，一些儿童临床研究表明，麻醉暴露可能会导致生命后期的神经发育缺陷。然而，临床前研究的理想动物模型尚未形成。新生小猪代表了临床前研究的一个有价值的模型，因为它们与人类具有许多发展相似之处。

仔猪的解剖和生理学允许在生存和非生存过程中实施严格的人围手术期条件。股动脉插管术允许密切监测，从而能够及时纠正仔猪生命体征和化学物质的任何偏差。一世此外，仔猪和人类新生儿之间存在多重发育相似之处。使用仔猪进行实验所需的技术将需要掌握经验。儿科麻醉师是调查小组的关键成员。我们在一般意义上描述了适合使用仔猪模型进行神经发育研究。

引言

每年，美国数百万儿童接受全身麻醉，其中许多儿童在4岁以下。麻醉诱发的发育神经毒性（AIDN）已经成为儿科麻醉研究的重点，因为了解麻醉对未成熟大脑的影响已成为当务之急。以前的研究表明，常用的麻醉药，如异氟烷，会引起年轻动物大脑神经细胞凋亡增加。对儿童的研究产生了不明确的结果² 。了解AIDN的发病机制，确定其预防或改善的潜在治疗靶点，并描述可用的最安全的麻醉方案已成为儿科麻醉社区的紧迫目标。本研究的主要目的是开发一种用于量化麻醉剂对发育中大脑的影响的最佳动物模型和方法，并仔细地刺激设计调查目前广泛使用的麻醉剂的安全性。

在最近对AIDN临床前文献的系统综述中，作者指出了超过900项研究中的重大方法异质性³ 。许多人认为这是一个呼吁临床相关，精心设计的临床前模型，尽管已经对这个问题进行了多年的研究，但尚不存在。绝大多数啮齿动物模型使用不允许严格生理监测，血液取样或机械通气的方法。由于大脑对生理紊乱非常敏感，很难依赖这些模型的结果。开发该模型的主要目的是设计它，以便在需要时监测和纠正所有生理变量，如血气参数，体温，呼吸参数等 。

4 。翻译小猪模型提供了在这些评论和社论中寻求的临床相关性水平，因为它旨在解决这一需要，可以为未来的临床研究提供相关的临床前数据。

异氟烷是一种GABA A型（GABA _A ）受体激动剂和弱NMDA受体拮抗剂，是全球临床实践中常用的吸入麻醉剂。只要不引起低血压或缺氧，异位异构体的麻醉剂就被认为是安全的;但是，可能会发生更微妙的影响。当大脑暴露于全身麻醉时，GABA的平衡aGonism和NMDA拮抗作用被破坏，导致细胞结构，连通性和功能的改变。此外，虽然GABA通常是抑制性神经递质，但已知在未成熟的脑中是兴奋的⁵ 。正确地，当GABA从兴奋性转变为抑制发生时，尚不清楚，并且很可能是物种依赖性的。

当在所谓的"大脑生长突发"期间发生大脑兴奋性和抑制性输入之间的不平衡时，所产生的关键分子途径的兴奋性毒性失调可能导致异常的神经发育，例如凋亡性神经变性。除增加细胞凋亡外，氧化应激和炎症也可能被诱导，而神经元细胞增殖，神经元迁移和轴突核移动被抑制或失调⁶ 。最终的结果是可能持续到adul的神经认知障碍你²

为了直接测量异氟烷对年轻哺乳动物的神经毒性作用，使用新生仔猪。与其他哺乳动物相比，小猪与人类有更多的CNS相似性，因此，他们的神经发育和神经解剖学相似性使它们成为临床相关的AIDN哺乳动物模型的理想动物。人类和仔猪都拥有脑卒中的脑，在脑回旋，灰质和白质的特征和分布中分享相似之处。小猪海马，基底神经节和脑干也与人类的形态相似⁷ 。发育上，仔猪是经历围产期脑部生长和髓鞘形成的少数非人类哺乳动物之一⁸ 。在子宫内，人和仔猪的大脑在妊娠晚期都经历显着的生长。在相关性方面，出生时，人和小猪的大脑分别是成人脑的27％和25％。磁共振成像显示，一周龄的仔猪大脑相当于一个月大的人脑，在神经元成熟和树突状态下⁹ 。此外，仔猪和人脑在神经发育模式方面有许多相似之处。例如，卷线蛋白^10的表达和mRNA序列，5-HT神经元¹¹和神经管闭合¹²的形貌分布全部与人类相似。此外，仔猪和人类的基因组之间存在广泛的同源性。

动物模型的相关性必须在人类病理学的背景下被理解，特别是关于人类婴幼儿的脑成熟和病理生物学。大多数现有麻醉毒性研究使用啮齿动物模型，少数使用非人类灵长类动物模型。然而，啮齿动物和灵长类动物可能不是调查艾滋病的理想动物。

虽然广泛使用，但在发展过程中，啮齿动物的大脑与人类大不相同。最值得注意的是，啮齿动物具有脑脊液（或平滑）的脑。啮齿动物的大脑缺乏更神经复杂的生物体的特征的回旋和ul。。啮齿动物的大脑也经历了与人类和仔猪不同的出生后大脑生长突变¹⁴ 。已经观察到，不同大脑区域对吸入麻醉剂的脆弱性有差异。因此，重要的是研究AIDN的动物模型具有神经发育和神经解剖学上类似于人类的脑，以便最好地模拟在儿科患者中可能看到的麻醉诱发的脑部改变。如前所述，仔猪拥有一只大脑，更适合这个角色。此外，啮齿动物神经认知测试的常见形式，如Morris水迷宫中评估的空间学习和记忆，并不直接相关或与幼儿的神经认知评估相媲美。使用仔猪进行发育神经科学的一个优点是，即使在小时候，它们也非常适合进行神经认知测试。被认为对其他哺乳动物物种有用的许多神经认知测试已经在猪中得到成功应用和验证。虽然仍然是一个不断发展的领域，仔猪的神经认知评估包括更复杂的测试，更好地模仿人类的缺陷，如斜梁运动测试^17,18和镜面空间意识测试¹⁹ 。作为小猪创伤性脑损伤研究的一部分，倾斜梁的电机测试在评估中显示出高可靠性的运动功能。镜像测试显示了周围环境的记忆，加上识别和利用反映的图像来寻找食物奖励。

另一方面，非人灵长类动物可能是儿科麻醉研究的更合适的模型，但是有一些禁忌因素，包括成本和使用难度。此外，它们对早期养殖条件非常敏感，特别是压力和母亲分离²⁰ 。对于AIDN研究重要的因素，如变构调节剂，受体 - 配体亲和力，翻译后修饰，受体亚单位组成和可变剪接变体，在灵长类动物的情况下是未知的。这是因为与这些概念相关的基因尚未克隆。相比之下，它们已被克隆在猪中。因此，在非人灵长类动物^{21,22 中}仅进行有限的工作。

仔猪模型利用了啮齿动物和非人类灵长类动物模型的优点:相对于非人类灵长类动物研究，它具有成本效益，易于使用，并且在神经解剖和神经生理学上类似于儿科人类大脑。近年来，使用仔猪进行神经科学研究已有所增加，其中包括一些研究小儿神经炎症状况的研究。呼吸道病毒感染对海马和空间学习的影响²³ ，减轻脑卒中后脑细胞死亡²⁴ ，创伤性脑损伤后的神经发生²⁵ ，癫痫发作期间的酶活性²⁶是使用新生仔猪的一些研究。这种大量和不断增长的文献体现了临床相关性和高度可重复性的仔猪研究麻醉方式的适用性和可持续性的强度sia诱导的神经毒性。

研究方案

健康的家养仔猪（ Sus scrofa）来自俄亥俄州立大学体育动物护理和使用委员会（IACUC）批准的农场。所有动物实验均按照俄亥俄州立大学IACUC政策执行，经议定书批准。

动物和动物处理

1. 在本实验中使用雄性仔猪消除性别的潜在混杂效应。注意:如果实验目标包括在最大脑生长期间评估实验对动物的影响，请勿使用长于14天的仔猪。
2. 安排仔猪在实验前至少24小时到达生殖群，以适应环境。
   注意:受过授权的兽医监督的经过培训的兽医技术人员提供常规动物护理。
   1. 将仔猪保存在各个温度控制的笼中，并给予营养商品小牛奶可随意购买。为动物提供毯子和玩具。连续监测动物围墙的温度。
3. 对于这项初步可行性研究，为对照组使用18只小猪为异氟烷臂和22头仔猪。在可能的基础上进行基于研究设计的样本量计算。将可利用的仔猪随机分配给对照组或暴露组，以适当的曝光时间。从经验来看，即使有多名调查员，也希望能够每天不超过2次实验（总共2只动物）。

控制动物

1. 不要对对照动物进行实验干预。
2. 通过面罩进行深度全身麻醉灌注和组织采集。具体来说，在24小时适应期后，用100％氧气中的5％异氟烷或8％七氟烷麻醉仔猪，通过面锥罩。不要使用地氟烷进行感应。
   注意:诱导麻醉和冷PBS灌注的时间应尽可能短。经验丰富的技术人员可以在5分钟内完成此过程。
   1. 通过使用手术夹钳缺乏露水夹点反射来确认足够的麻醉深度。
   2. 为了避免对大脑的缺氧/缺血性损伤，使用脉搏血氧计监测仔猪，以确保维持足够的氧合，通气和心输出量，直到冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注开始。
      注意:为了提供额外的组织损伤保护，在诱导麻醉后将动物（包括头部）装入冰中。
3. 进行经心脏灌注。
   注意:由于使用多聚甲醛，灌注程序应在通风橱或下降式桌子下进行。
   1. 做一个骷髅头我沿着胸骨的长度使用手术刀切割。切口的深度应足以暴露胸骨。
   2. 仔细地用一把锋利的重型剪刀进行中线胸骨切开术，避免损伤心脏，肺或膈肌。如有必要，将手指放置在胸骨后部与胸腔内容物之间，以避免受伤。通过在隔膜中进行小（手指大小）的切口来操纵手指进入纵隔。
   3. 进入胸腔后，用自锁式牵开器将肋骨保持打开状态。
   4. 使用镊子和一把剪刀切开心包膜，暴露心跳。小心不要伤心。
   5. 识别左心室，并仔细放置插管（如14 G血管导管）穿过心室的顶点。取下针头，将导管放在适当位置。
      注意:注意不要刺穿心室后壁。来自导管的脉动血液回流指示它被正确放置。此时可以从动物中轻松取样血液。
   6. 在确定右心房后，用剪刀在中庭大切口进行切开术，以便放血和排泄灌注液。
      注意:通过吸入的异氟烷应持续进行，直到心脏死亡得到证实。通过直接观察到心输出量不足证实心脏死亡。
4. 使用由冷组成的灌注液灌注仔猪（4 ℃）含有浓度为5单位/ mL的肝素的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。以每分钟300mL的速度冲洗5分钟，或直到溶液清洁。
   1. 注意灌注期间灌注插管不会脱落。使用市售的蠕动泵进行这种和所有其他灌注。
5. 进行半切除术移动脑的一个半球进行新鲜的组织分析。
   注意:该协议允许检索新鲜脑组织的一个半球。另一个半球是固定的。如果不需要新鲜的纸巾，请跳至步骤2.6。
   1. 在此过程中，继续以每小时50毫升的速度循环冰冷的PBS，以确保大脑保持冷。
   2. 沿着矢状缝合的长度在头皮中做一个纵向切口，直到使用手术刀的孔的大小。在此过程中，使用坚定的压力在头骨中创造一个分数。反映头皮暴露整个头颅。
   3. 使用长颈鹿并从孔中开始，通过在颅骨和硬脑膜之间插入桡骨头，使用小心不要伤害下面的脑组织，从而将头骨移开。用骨头去除骨头，将其从脑实质中撬开。
   4. 一旦颅骨被移除，切开并移除颅骨使用镊子和剪刀，再次小心不要伤害潜在的脑组织。
   5. 在两个半球之间放置手术刀刀片，以小心地分开胼the体。
   6. 使用扁平工具，如镊子的宽手柄末端，轻轻地收回额叶，逐渐切断颅神经，向前后方向工作。在半球的最后部，使用手术刀切割脊髓。移除整个半球。
      注意:未固定的脑组织是脆弱的。取出半球时要小心，以防止剩下的半球血液供应中断。
   7. 切除已移除的半球。如果指示，立即在液氮浴中冷却至-160℃的2-甲基丁烷中快速冷冻，以避免组织破裂，并立即储存于-80℃以备后续分析。
      注意:我们建议使用矩阵以2毫米为单位进行冠状动脉切除冠状动脉，但需要特定的定位切片将取决于具体的实验目标。
6. 将灌注液更换为4％多聚甲醛（PFA）。继续P300灌注，每分钟300毫升至少5分钟。
   警告！ PFA有毒，避免与皮肤，眼睛或粘膜接触。不要吸入PFA烟雾。
7. 期望由于在肌肉中形成醛交联而使仔猪的身体变硬。在PFA灌注完成后，以与步骤2.5.5中所述相同的方式去除剩余的半球。
   注意:正确灌注的大脑会变苍白，完全放血。
   1. 将剩余的半球置于4℃的新鲜4％PFA的小容器中。保持半球在PFA 24-48小时完成固定过程。
   2. 24-48小时后，将固定的脑移动到含有0.1％叠氮化钠的PBS溶液中，因为防止过度固定是必要的。过度固定可能导致mas国王的表位或强非特异性背景染色。加入叠氮化钠可防止细菌生长。
      注意:组织可以在4°C下储存长达一个月。

3.异氟烷（实验）动物

注意:可以使用任何麻醉或干预措施，但我们不建议使用地氟烷进行吸入诱导。

1. 诱导和维持麻醉:
   1. 使用装有儿科呼吸机和监测装置的临床麻醉工作站进行麻醉。
   2. 在24小时适应期后，通过面锥罩将100％O ₂中的8％七氟醚麻醉。
   3. 在诱导期和研究过程中的任何时候，持续监测脉搏血氧饱和度，无创血压，心电图和温度。
   4. 诱导后滴定七氟醚或异氟醚以达到足够的麻醉深度同时确保持续的自发呼吸（通常浓度为3-4％）的浓度。
   5. 将24 G外周静脉导管置于边缘耳静脉（ 图1 ）。
   6. 将仔猪置于背侧卧位，用于气管插管（ 图2 ，图A）。使用Miller＃1或＃1.5刀片，以便于气管下咽管插管。注意:在喉镜检查期间需要有经验的操作员和助手。
      1. 助手用干燥的纱布替代动物的舌头，以方便喉部的暴露和声带的可视化（ 图 2B ）。
         注意:会厌仔猪的形态学类似于人类（ 图 2C ）。小猪唱歌公司ds可能难以可视化，因为它们在喉入口内几毫米深（ 图 2D ）。
      2. 放置会厌:将喉镜尖端放在会厌下面，向上提起刀片以暴露喉。
      3. 在将管置入气管之前，用0.5mL的2％利多卡因喷雾声带，以防止在气管插管通过期间的喉痉挛，因为仔猪特别容易发生喉痉挛。
   7. 放置并固定3.0毫米袖口气管插管。
      1. 使用听诊器和EtCO ₂监测，使用胸部听诊确保双侧呼吸音和持续的潮气二氧化碳。
      2. 将仔猪的肺充气至20 cm H ₂ O的连续气道压力。然后，将气管内管的气囊充气至所需的最小压力，以防止压力为20 cm H的空气泄漏 _{2 O，听取气管，以确定存在的空气泄漏。
         注意:这对于在间歇性正压通气期间防止粘膜缺血是重要的。}
      3. 在麻醉过程中维持正常和正常的感觉。
   8. 在50％氧气/ 50％空气中开始给予2％异氟烷。滴定氧气以保持PaO ₂为90-100mmHg。持续3小时（或期望的实验持续时间）。
   9. 在眼睛上涂上眼科软膏，以防止麻醉期间的干燥。
2. 开始2％异氟烷后开始股动脉插管。
   1. 通过外周静脉注射管理广谱抗生素预切口（头孢唑啉，25 mg / kg） ，以防止手术部位感染。
   2. 使用有色氯己定灭菌两只腹股沟，以确保适当的无菌田，并放置适当的无菌悬垂（ 图3 B ）。 至少，参加生存手术的工作人员应佩戴手术帽，面罩，无菌手套和眼睛保护。
   3. 使用指数和中指在腹股沟折痕处掌握股动脉。
   4. 使用手术刀做一个浅表，1.5厘米的头骨切口（ 图3 C ）。
   5. 使用钝器仪器（如手术止血钳或钝头剪刀）解剖粗糙肌肉的两个头部（ 图3 D ）。
      注意:股骨神经血管束通常发现在这两只肌肉之间，并且仅深入这两只肌肉。 （ 图4A ）。
   6. 使用血管环或丝带，隔离近端和远端的动脉。使用回路将动脉向上拉到皮肤水平（ 图4 B ）。
   7. 而将牵引力放置在近端绑带上，足以中断血流，用一对十足剪刀做小动脉切开术。
      1. 注意不要横断动脉。小动脉切开术就足够了。或者，使用针和线方式进入动脉（ 图 4C）。
      2. 近端扎带上的温和牵引力可以防止在手术过程中的任何一点出现过多的失血。如果使用针和线接近，请将导丝（随套件提供或单独获得）穿过针头并进入动脉至5厘米。
      3. 注意不要进一步推进电线，因为它可能导致心室异位。如果发生这种情况，立即将电线拔出1-2厘米。
   8. 从容器中取出针头，注意将导丝线放在容器中。轻轻地将导管穿过导线并进入容器（ 图4） D）。
      1. 使用3法国8厘米的导管进行股动脉插管术。当导管的尖端首先进入血管的浅表壁时，预期温和的阻力。
   9. 如果使用动脉切开术，将导管或聚乙烯管直接推入血管。应立即观察血液回流。
   10. 立即将导管连接到压力传感器上。用生理盐水冲洗导管以维持导管通畅。
       1. 放置缝合线将导管固定到位。用无菌纱布覆盖切口以防止污染。利用经皮途径进行股动脉插管术。
          注意:确保超声波由经验丰富的技术人员执行。
3. 手术条件和监测:
   1. 用强制空气加温装置对仔猪进行积极的保暖，并持续监测直肠温度（ 图3A ）。
   2. 以维持率（猪仔重量，千克，mL / hr）维持率，将含葡萄糖的等渗液（林格氏乳酸盐或生理盐水中的5％葡萄糖）浸泡。
   3. 监测扰动的生命体征（低血压，心律失常，低温/高热，缺氧）
      注意:异常情况下，正常生命体征范围和相应建议的管理情况如表1所示 。
   4. 使用市售的血液分析系统，在实验期间至少每小时测量动脉血气（动脉pH，pCO ₂ ，pO ₂ ），电解质（碳酸氢盐，碱过量/缺乏，钠，钾，离子钙），血红蛋白和葡萄糖期。从股动脉导管抽取动脉血样。
      注意:正常酸碱和电解质值以及如果出现异常，则进行校正的建议重复总结在表1中 。
4. 3小时异氟烷暴露后，取出股动脉导管。
   1. 仔细绑扎近端血管丝以永久性闭塞股动脉以防止出血。或者，使用血管夹。
   2. 在关闭切口前确保完全止血。用10-20毫升无菌盐水溶液冲洗切口，以防止感染。
5. 在实验结束时，使用3-0不可吸收的缝合材料，用简单的中断缝线闭合皮肤切口。
   1. 使用0.5-1 mL / kg 0.25％布比卡因和1:200,000肾上腺素浸润伤口，用于疼痛控制。用无菌的手术皮肤粘合剂涂上切口。
      注意:不需要敷料。
6. 停止麻醉，让仔猪醒来。
7. 在awa的迹象上移除气管内管开心（眼睛开放，试图站立，踢，打开和关闭嘴巴），具有稳定的血液动力学，足够的氧合和足够通气的迹象。
8. 拔管后，通过面锥补充氧气，直到充足的氧合和通气得到保证。
9. 皮下注射丁丙诺啡0.05 mg / kg，进行更多的疼痛控制。或者，可以使用透皮芬太尼。
10. 在适当的时候，将仔猪送回家中。在重新获得足够的意识以维持胸骨躺卧之前，不要离开小猪无人看管。不要将动物带回其他动物的笼子，直到它完全从麻醉中恢复。
    1. 用温暖的灯光积极地加热私人家庭笼子。
    2. 训练有素的兽医或研究人员在麻醉后密切监测动物。提供仔猪奶替代品。
11. 让仔猪恢复48-72小时，取决于实验目标。
    1. 根据需要每3小时皮下注射丁丙诺啡，以确保疼痛控制，经验丰富的动物护理人员可以控制动物的手术后不适感染皮下注射仔猪。
    2. 在手术后的头6h，每4小时监测一次仔猪。以相同的方式进行动物牺牲和组织采购以控制上述动物。

结果

研究了40头仔猪（18个异氟烷，22个对照）。所有动物的研究程序都能很好地耐受。所有仔猪都是男性。各组之间在年龄或体重方面差异无统计学意义（ 表2， 图5 ）。在异氟烷组实验过程中的平均实验室值见表3 。这些值表明，实验方案具有内部一致性和重复性，因为我们有多名技术人员在两年内进行手术。没有这些数字是我们在手术过程中进行的许多调整和修正，以维持生理止血。 CO ₂保留，低核心体温和低血糖是我们通过综合监测和调整所必需的许多混淆因素中的一些。

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图1:。外周静脉注射放置。 24 G静脉导管放置在边缘耳静脉。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2:小猪插管事件的顺序。 （ A ）将仔猪放置在侧卧位置进行插管。放置标准显示器。 （ B ）喉镜喉镜检查时，助手将舌头从口腔排出。 （ C ）会厌在形态上类似于人的会厌。在这个图形中，e刀片在vallecula。 （ D ）猪喉解剖与人类明显不同;声带距喉口几毫米深。在这个图形中，刀片尖端已经使会厌位移，露出喉。 请点击此处查看此图的较大版本。

图3:股动脉方法。 （ A ）使用强制空气加温装置维持动物温度。在整个程序中使用监控。用有色洗必泰制备广泛的无菌田，并用开窗无菌悬垂覆盖动物。 （ B ）腹股沟的触诊显示股动脉。 （ C ）大体上垂直于腹股沟皱纹并且长约1.5cm的阴茎皮肤切口被覆盖在股骨脉冲上。 （ D ）实现钝性解剖以暴露股骨神经血管束。 请点击此处查看此图的较大版本。

图4:股动脉插管。 （ A ）从外侧到内侧，神经血管束包含股神经，动脉和静脉。 （ B ）使用血管环和/或缝线分离股动脉。近端连接处的持续张力可防止动脉穿刺时出现过多的失血（见容器美白）。 （ C ）用针刺穿股骨a动脉，避免动脉后壁穿孔。当血液返回时，导丝通过针头进入动脉。 （ D ）取出针头，将导管推进导丝进入 股动脉。 请点击此处查看此图的较大版本。

图5:对照和异氟烷处理的仔猪的平均体重和年龄的比较。误差条表示+/- 1标准偏差，标准偏差值在每个误差栏上方。

表1:正常小猪生命体征总结，动脉al血气和血清电解质值与建议的修正方法。 请点击这里查看此表的较大版本。

表2:对照与异氟烷治疗的仔猪的平均体重和年龄的总结。进行不成对的双尾T检验，两组间差异无统计学意义。 请点击这里查看此表的较大版本。

表3:异氟烷治疗动物的平均生命体征和实验室价值。在过程中手术，生命体征和实验室值与正常范围的偏差及时纠正。 请点击这里查看此表的较大版本。

讨论

关键协议步骤/故障排除

随着实验开始，非侵入性生命体征的监测应从诱导开始。可以容易地获得和监测血压，心率，氧饱和度和直肠温度。仔猪应该在一个暖气装置下保持足够的核心体温，因为这些动物可以在全身麻醉下迅速变得低温。外周静脉导管的及时放置允许在诱导期间出现紧急情况。重要的是在整个异氟烷过程和牺牲程序中连续监测小猪，非侵入性或侵入性。在整个方案中，仔猪可以在多个步骤中，特别是在气道管理和插管过程中，能够非常快速地体验动脉氧饱和度。我们使用8％的七氟醚诱导麻醉，以复制人类儿科实践和刺激d感应。但是，5％异氟烷已经成功使用并且是合适的。鉴于解剖学上的差异和咽喉痉挛的倾向，仔猪难以插管。如果在诱导和/或气道管理期间小猪开始脱饱和，则应立即通过面锥管理100％的氧气和七氟醚，以便重新建立安全的氧饱和度水平和足够的麻醉深度。记住，当麻醉平面必须足够深以允许插管时，过度麻醉可能导致呼吸暂停。需要对动物的通气和氧合持续警惕，并相应地滴入吸入麻醉剂。一旦氧合恢复并且已经达到充分的麻醉，则可以重新插管插管。可以尝试通过面锥进行正压通气，但通常不成功。如果发生喉痉挛，将利多卡因溶液直接施用于voc指示允许气管插管。

紧急药物应始终可用，并且应在协议的关键部分根据需要进行治疗以纠正生理紊乱。尽管仔细讨论了仔猪的麻醉和紧急药物使用不在本手稿范围之内，但Swindle的"实验室中的猪:手术，麻醉，成像和实验技术"是一个很好的资源。 ²⁷

类似地，在中线胸骨切开术期间打开胸腔后，仔猪可以在牺牲期间开始快速去饱和。操作者应尽快工作，安全地暴露心脏并插入血管导管以开始冷PBS。需要彻底的冷PBS灌注（如果指示使用PFA快速固定），以防止对脑的缺血性损伤。

一旦仔猪插管，呼吸开始进行压缩率和尾气二氧化碳跟踪（ 表1 ）。通过滴定呼吸机支持同时保持足够的麻醉来稳定仔猪的潮气充氧和通气。我们使用机械通气来尽可能地模拟人类使用的物质。应避免高氧，以尽量减少氧化应激的机会。

异氟烷仔猪经历股动脉插管有两个原因:持续监测动脉血压;并在整个程序中采集动脉血来评估酸碱状态，血气和电解质。股动脉的插管是有挑战性的。请参阅影片的详细资料。对于生存实验，该程序应在无菌条件下的无菌操作环境中进行。在插入股动脉后，开始每小时监测动脉血气和血清电解质，根据需要进行校正维持体内平衡（ 表1 ）。小猪应接受含葡萄糖的连续等渗液以维持足够的血糖。在整个实验过程中，应持续监测动物的体温，并根据需要提供强制空气加温。避免体温过低和高热也同样重要。

虽然这个协议提供了一个"新鲜"脑半球和固定神经组织的一个半球，但这可以很容易地适应于替代的研究设计。也可以从仔猪收集额外的样品。在仔猪麻醉后可以获得CSF，有或没有荧光透视指导。也可以在方案的各个阶段从包括股动脉导管在内的小猪收集血液，以及在灌注之前立即通过血管导管从左心室收集血液。恢复期也可以延长或减少分别用于检查慢性或急性反应。

技术的局限性

该协议和模型在技术上是具有挑战性的。需要熟练的调查员和完全提供的操作套件，特别是对于生存实验。调查员（和助理，对于协议的某些部分）必须对本协议的手术和麻醉成分都感到舒适，这可能需要培训和经验来掌握。其他限制包括仔猪相对于啮齿动物模型的费用，尽管仔猪模型比非人类灵长类动物成本低得多。虽然仔猪的成本将根据获得动物的地区和农场而有所不同，但可以预期每只动物的成本低于500美元，而非人类灵长类动物的数量可以是每只动物数千美元。根据我们的经验，每只动物的平均成本通常约为200美元。

最后，由于仔猪模型的目的是模仿发育中的人类大脑，所以只能使用新生儿仔猪，中枢神经系统在快速生长期间是最脆弱的，而在仔猪期间，这一时期从出生后六周，出生后五周⁸ ，使用距离分娩日期更远的较长的仔猪，有降低仔猪模型临床意义的风险，而对于仔猪大脑发育的"等效性"则存在重大争议人类和猪的早期出生后大脑发育相比，人类新生儿的发育有惊人的相似之处。人类和猪的大脑分别是成人体重的27％和25％。14基于约翰逊的工作和同事，我们可以推断出一个仔猪周大致相当于一个人月^。9这些结果基于wh油脑体积数据，已经通过Workman及其同事的工作验证。 ²⁸我们选择了7-14日龄的仔猪，以估计1-2个月的人口。然而，如果实验目标是模拟仔猪脑生长发育的顶峰，可能审慎使用年轻动物（1-5天龄）。这是可行的，因为仔猪可以在出生时断奶。我们使用仔猪模型将适应新的数据可用于人与猪出生后大脑发育的相似之处。

关于替代/现有方法的技术意义

仔猪与人类新生儿具有惊人的相似之处，包括脑部发育和病理生理反应中的关键平行。因此，它是临床相关的哺乳动物模型，概念验证研究表明，仔猪是麻醉神经毒性研究的合适模型参考文献"29,30 ^，也可以轻松适应其他类型的发展神经科学研究，该模型旨在通过科学权威调查AIDN的程度和机制，最大限度地减少混合因素（如缺氧或高碳酸血症）的担忧导致麻醉引起的神经损伤，为了达到这个目的，仔猪用相同的手术和麻醉条件和儿科病人的监测进行治疗。

掌握技术后的未来方向和应用

向前走，仔猪也非常适合神经认知测试¹⁷ 。这个属性将允许对未来实验中麻醉剂暴露后的神经认知结果进行复杂，全面的评估。还应该强调的是，在临床环境中，儿童最常接受麻醉生理压力程序（手术）。麻醉和手术后炎症之间的相互作用以及所产生的神经元损伤和/或毒性（如啮齿动物和灵长类动物中所见）值得进一步探索和重要考虑。新生仔猪提供了一个独特的临床相关的基线模型，用于麻醉剂对发育中大脑的影响，而没有手术的混杂影响（模仿儿童常见的临床情况）。现在可以使用该模型可靠地测试不同类型手术或其他混杂因素（缺血，脑损伤，遗传易感性等 ）的影响。

在实验室，我们计划使用多种电生理和电化学方法进一步研究完整神经回路中麻醉和AIDN的机制。这些技术包括体内测量神经递质活性，全细胞膜片钳记录，神经成像和脑切片中的神经生理学研究。对于未成熟脑中的神经科学，与非人类灵长类动物存在很少缺点的小鼠模型相比，仔猪与人相关。随着进一步发展，仔猪可能是人类发展神经科学研究的理想模式。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liqui-Wean	Milk Specialities	454836
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask	VetEquip	921428
Masterflex L/S Peristaltic Pump	Cole-Parmer	EW-77916-20	Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved
Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft	Cole-Parmer	EW-96410-24
14 G angiocatheter	Becton-Dickson	381164
10x PBS	Thermo-Fisher Scientific
Paraformaldehyde powder	Sigma-Aldrich	P6148-5KG	Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased.
2-methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631-4L
Needle holder	Teleflex	152720
Right angle clamp	Teleflex	496217
Rongeurs	Teleflex	028120
Tenotomy scissors	Teleflex	423480
Stitch scissors	Teleflex	423440
McPherson Tying Forceps	Teleflex	425200
Adson Tissue Forceps	Teleflex	181223
3-0 nylon suture	Medline	ETH627H
Integra SL Anesthesia Workstation	DRE Veterinary	2350	This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.
Laryngoscope handle	Teleflex	8710000
Miller 1 Laryngoscope blade	Teleflex	2216100
Bair Hugger	3M	750
Bair Hugger Torso Blanket	3M	540
iStat Handheld	Abbott Point of Care	300	Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used
iStat Cartridges	Abbott Point of Care	CG8+
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive	Ethicon	DNX6
LMA Laryngotracheal Atomization Device	Teleflex	MAD720	A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube	Teleflex	5-10106	This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment
Pediatric Intubation Stylet	Smiths Medical	100/120/100
24 G angiocatheter	Becton-Dickson	381112
#10 Disposable Scalpel	Ted Pella, Inc	549-9-10
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter)	Cook Medical	C-PMSY-300-FA	Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used
Intramedic PE90 Polyethylene tubing	Fisher Scientific	14-170-12D
Monoject Blunt Cannula	VWR International	15141-144