Uso de un Modelo de Cochinillo para el Estudio de la Neurotoxicidad de Desarrollo inducida por Anestesia (AIDN): Un Enfoque de Neurociencia Translacional

Resumen

La investigación sobre la neurotoxicidad del desarrollo inducida por la anestesia (AIDN) se ha centrado en los roedores, que no son ampliamente aplicables a los seres humanos. Los modelos de primates no humanos son más relevantes, pero son costo prohibitivos y difíciles de usar para la experimentación. El lechón, por el contrario, es un modelo animal clínicamente relevante y práctico, ideal para el estudio de la neurotoxicidad anestésica.

Resumen

La anestesia no se puede evitar en muchos casos cuando se requiere cirugía, particularmente en niños. Recientes investigaciones en animales han planteado preocupaciones de que la exposición a la anestesia puede conducir a la apoptosis neuronal, conocida como anestesia inducida por la neurotoxicidad de desarrollo (AIDN). Además, algunos estudios clínicos en niños han sugerido que la exposición a la anestesia puede conducir a déficit neurodevelopmental más adelante en la vida. Sin embargo, todavía no se ha desarrollado un modelo animal ideal para el estudio preclínico. El lechón neonatal representa un modelo valioso para el estudio preclínico, ya que comparten un sorprendente número de similitudes de desarrollo con los seres humanos.

La anatomía y la fisiología de los lechones permiten la implementación de rigurosas condiciones perioperatorias humanas tanto en los procedimientos de supervivencia como de no supervivencia. El cateterismo de la arteria femoral permite un monitoreo cercano, permitiendo así la corrección inmediata de cualquier desviación de los signos vitales y químicas del lechón. yoAdemás, existen múltiples similitudes en el desarrollo entre los lechones y los neonatos humanos. Las técnicas necesarias para utilizar los lechones para la experimentación requerirán experiencia para dominar. Un anestesiólogo pediátrico es un miembro crítico del equipo de investigación. Describimos, en un sentido general, el uso apropiado de un modelo de lechones para el estudio del desarrollo neurológico.

Introducción

Cada año, millones de niños en los Estados Unidos reciben anestesia general, muchos de ellos menores de 4 años ¹ . La neurotoxicidad del desarrollo inducida por anestesia (AIDN) se ha convertido en un foco de investigación en anestesia pediátrica, ya que se ha convertido en un imperativo para comprender los efectos de la anestesia en los cerebros inmaduros. Investigaciones anteriores han demostrado que los anestésicos de uso común, como el isoflurano, pueden causar una mayor apoptosis neuronal en los cerebros de animales jóvenes. Los estudios en niños han dado resultados equívocos ² . La comprensión de la patogénesis del AIDN, la identificación de potenciales objetivos terapéuticos para su prevención o mejoramiento y la descripción de los regímenes anestésicos más seguros disponibles se han convertido en objetivos urgentes de la comunidad de anestesia pediátrica. El objetivo principal de este estudio fue desarrollar un modelo animal y un método óptimo para cuantificar los efectos de los anestésicos en el cerebro en desarrollo y estimular cuidadosamenteDiseñó una investigación sobre la seguridad de los anestésicos actualmente ampliamente utilizados.

En una revisión sistemática reciente del cuerpo actual de la literatura preclínica sobre AIDN, los autores observaron significativa heterogeneidad metodológica en más de 900 estudios [ ^3] . Muchos consideraron que se trataba de un llamamiento a un modelo preclínico clínicamente relevante y bien diseñado, que aún no existe a pesar de varios años de investigación sobre este tema. La mayoría de los modelos de roedores, por necesidad, usan un enfoque que no permite monitoreo fisiológico riguroso, muestreo de sangre o ventilación mecánica. Dado que el cerebro es exquisitamente sensible a los trastornos fisiológicos, es difícil confiar en los resultados de tales modelos. Un objetivo primordial para el desarrollo de este modelo fue diseñarlo de tal manera que todas las variables fisiológicas tales como parámetros de gas en sangre, temperatura corporal, parámetros respiratorios, etc. sean monitoreados y corregidos cuando sea necesario.

4 . El modelo de lechones traslacional proporciona el nivel de relevancia clínica buscado en estas revisiones y editoriales, ya que está diseñado para abordar esta necesidad de datos preclínicos pertinentes que puedan servir de base a futuros estudios clínicos.

El isoflurano, un agonista del receptor GABA tipo A (GABA _A ) y un antagonista débil del receptor NMDA, es el anestésico inhalado de uso común en la práctica clínica en todo el mundo. Los anestésicos como el isoflurano se han considerado seguros siempre y cuando no induzcan hipotensión o hipoxia; Sin embargo, pueden producirse efectos más sutiles. Cuando el cerebro está expuesto a la anestesia general, el equilibrio de GABA aGonismo y antagonismo de NMDA se interrumpe, dando por resultado alteraciones en la arquitectura celular, la conectividad, y la función. Además, aunque GABA es generalmente un neurotransmisor inhibitorio, se sabe que es excitador en los cerebros inmaduros [ ^5] . Precisamente cuando la transición de GABA de excitador a inhibitorio ocurre no se entiende bien, y es probablemente dependiente de la especie.

Cuando un desequilibrio entre la entrada excitatoria e inhibitoria en el cerebro se produce durante el llamado "brote de crecimiento cerebral", la desregulación excitotóxica resultante de las vías moleculares críticas puede conducir a un neurodesarrollo anormal, como la neurodegeneración apoptótica. Además de un aumento de la apoptosis, el estrés oxidativo y la inflamación también pueden ser inducidos, mientras que la proliferación de células neuronales, la migración neuronal y axonal arborization se suprimen o dysregulated [ ^6] . El resultado neto son las alteraciones neurocognitivas que pueden persistir en adulRitmo ² .

Para medir directamente los efectos neurotóxicos del isoflurano en los mamíferos jóvenes, se utilizan lechones neonatales. Los lechones comparten más similitudes del SNC con los seres humanos que cualquier otro mamífero, y como tal, sus similitudes neurodevelopmental y neuroanatómicas las convierten en un animal ideal para un modelo clínicamente relevante de AIDN de mamíferos. Tanto los seres humanos como los lechones poseen cerebros gyrencephalic, compartiendo semejanzas en el carácter y la distribución del gyri del cerebro, la materia gris, y la materia blanca. El hipocampo de los lechones, los ganglios basales y el tronco encefálico también son topográficamente similares a los de los seres humanos ⁷ . Desde el punto de vista del desarrollo, los lechones son uno de los pocos mamíferos no humanos que experimentan crecimiento cerebral perinatal y mielinización ⁸ . En el útero, los cerebros humanos y de los lechones experimentan un crecimiento significativo durante la gestación del último trimestre. En correlación, al nacer, los cerebros humanos y de lechones son 27% y 25% de cerebros adultos, respectivamente. La resonancia magnética ha revelado que un cerebro de cochinillo de una semana de edad es aproximadamente equivalente a un cerebro humano de un mes de edad en términos de maduración neuronal y arborización dendrítica [ ^9] . Además, el cochinillo y el cerebro humano comparten numerosas similitudes con respecto a patrones de neurodesarrollo. Por ejemplo, la expresión y la secuencia de mRNA de la reelina ¹⁰ , la distribución topográfica de las neuronas 5-HT ¹¹ y el cierre ¹² del tubo neural son todas paralelas a la que se observa en los seres humanos. Además, hay una amplia homología entre los genomas de los lechones y los seres humanos [ ^13] .

La relevancia de un modelo animal debe entenderse en el contexto de la patología humana, particularmente en relación con la madurez cerebral y la patobiología del niño humano. La mayoría de los estudios de toxicidad de la anestesia existentes utilizan un modelo de roedor, con unos pocos utilizando no humanosModelos de primates. Sin embargo, los roedores y los primates pueden no ser los animales ideales para investigar el AIDN.

Aunque ampliamente utilizados, los cerebros de roedores son muy diferentes de los humanos durante el desarrollo. Lo más notable es que los roedores poseen cerebros lissencefálicos (o lisos). El cerebro de roedor carece de los giros y sulcos que son característicos de organismos neurológicamente más complejos. El cerebro de roedor también experimenta un chorro de crecimiento cerebral postnatal ¹⁴ , disímiles a los seres humanos y los lechones. Se ha observado que existen variaciones en la vulnerabilidad de diferentes regiones cerebrales a la anestesia inhalada ¹⁵ . Por lo tanto, debe ser importante que el modelo animal para estudiar AIDN posea un cerebro neurodevelopmentally y neuroanatómicamente similar al de un ser humano, para modelar mejor las alteraciones cerebrales inducidas por anestesia que es probable que se vea en pacientes pediátricos. Como se ha descrito anteriormente, los lechones poseen un cerebro que iEs mucho más adecuado para este papel. Además, las formas comunes de pruebas neurocognitivas de roedores, como el aprendizaje espacial y la memoria evaluados en el laberinto de agua de Morris, no son directamente relevantes o comparables con las evaluaciones neurocognitivas en niños pequeños ¹⁶ . Una de las ventajas del uso de lechones para la neurociencia evolutiva es que son extremadamente susceptibles a las pruebas neurocognitivas, incluso a una edad temprana. Numerosas pruebas neurocognitivas que se consideran útiles para otras especies de mamíferos se han utilizado y validado con éxito en cerdos. Aunque todavía es un campo en evolución, la evaluación neurocognitiva en los lechones incluye pruebas más complejas que mejor imitan los déficits humanos, tales como una prueba de motor de viga inclinada ^{17 , 18} y una prueba de conciencia espacial de espejo ¹⁹ . Las pruebas motoras con el haz inclinado, como parte del estudio de lesiones cerebrales traumáticas en lechones, muestran una alta fiabilidad en la evaluaciónDe la función motora. La prueba del espejo demuestra memoria del ambiente circundante más el reconocimiento y la utilización de una imagen reflejada para buscar la recompensa del alimento.

Por otro lado, los primates no humanos pueden ser un modelo más apropiado para los estudios de anestesia pediátrica, pero hay una serie de factores prohibitivos, incluyendo el costo y la dificultad de uso. Además, son extremadamente sensibles a las condiciones de crianza temprana, particularmente el estrés y la separación materna ²⁰ . Los factores importantes para el estudio de AIDN, tales como moduladores alostéricos, afinidades receptor-ligando, modificaciones post-traduccionales, composiciones de subunidades de receptores y variantes de empalme alternativo, se desconocen en el caso de primates. Esto se debe a que los genes relevantes para tales conceptos no han sido clonados. En cambio, se han clonado en cerdos. Como tal, sólo se ha realizado un trabajo limitado en primates no humanos ^{21 , 22}

El modelo de los lechones aprovecha las ventajas de los modelos de roedores y primates no humanos: es rentable, fácil de usar en relación con los estudios de primates no humanos y es neuroanatómico y neurofisiológicamente similar al cerebro humano pediátrico. El uso de cochinillo en la investigación de la neurociencia ha crecido en los últimos años, incluyendo una serie de estudios que han examinado las condiciones neuroinflamatorias pediátricas. Los efectos de la infección viral respiratoria en el hipocampo y el aprendizaje espacial ²³ , la reducción de la muerte de las células cerebrales tras el accidente cerebrovascular ²⁴ , la neurogénesis tras la lesión cerebral traumática ²⁵ y la actividad enzimática durante las convulsiones ²⁶ son algunos de los estudios que han utilizado lechones neonatales. Este cuerpo sustancial y creciente de literatura da fuerza a la idoneidad y sostenibilidad del modelo de lechones clínicamente relevante y altamente reproducible para el estudio del anestheSia inducida por neurotoxicidad.

Protocolo

Los lechones sanos ( Sus scrofa) se obtienen de una granja aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (IACUC). Todas las experimentaciones con animales se realizan de acuerdo con la política de IACUC de la Universidad Estatal de Ohio, después de la aprobación del protocolo.

1. Animales y Manejo de Animales

1. Utilice los lechones machos en este experimento para eliminar los posibles efectos confusores del sexo. NOTA: Si los objetivos experimentales incluyen la evaluación de los efectos del experimento en animales mientras están en el período de crecimiento máximo del cerebro, no use lechones mayores de 14 días.
2. Programe que los lechones lleguen al vivero al menos 24 h antes de la experimentación para permitir la aclimatación al medio ambiente.
   NOTA: Técnicos veterinarios entrenados bajo la supervisión de veterinarios con licencia proveen cuidado rutinario de animales.
   1. Mantenga los lechones en jaulas individuales de temperatura controlada yNalmente completo, sustituto comercial de leche de lechón ad libitum. Suministre a los animales con una manta y un juguete. Supervise continuamente la temperatura en los recintos de los animales.
3. Para este estudio de viabilidad preliminar, se utilizaron 18 lechones para el brazo de isoflurano y 22 lechones para el brazo de control. Realizar cálculos del tamaño de la muestra basados ​​en el diseño del estudio cuando sea posible. Aleatorizar los lechones disponibles para control o grupo de exposición para la duración adecuada de la exposición. De la experiencia, incluso con múltiples investigadores, esperan poder realizar no más de 2 experimentos por día (2 animales en total).

2. Control de animales

1. No realizar la intervención experimental en animales de control.
2. Inducir la anestesia general profunda a través de máscara de cono facial para el procedimiento de perfusión y recolección de tejido. Específicamente, después del período de 24 h de aclimatación, anestesiar los lechones con isoflurano al 5% o sevoflurano al 8% en oxígeno al 100%Em> a través de la máscara facial. No use desflurano para la inducción.
   NOTA: El tiempo entre la inducción de la anestesia y la institución de la perfusión de PBS frío debe ser lo más corto posible. Técnicos experimentados pueden completar este proceso en menos de 5 min.
   1. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia por falta de reflejo pinch-dewclaw usando una abrazadera quirúrgica.
   2. Para evitar insultos hipóxicos / isquémicos en el cerebro, monitoree el cochinillo usando un oxímetro de pulso para asegurar el mantenimiento de la oxigenación, ventilación y gasto cardiaco adecuados hasta que comience la perfusión de solución salina con tampón fosfato frío (PBS).
      NOTA: Para proporcionar protección adicional contra el daño tisular, empaque el animal (incluyendo la cabeza) en hielo después de la inducción de la anestesia.
3. Realizar una perfusión transcardiaca.
   NOTA: dado que se utiliza paraformaldehído, el procedimiento de perfusión debe realizarse bajo una campana extractora de humos o sobre una mesa de corriente descendente.
   1. Hacer una craniocaudal iA lo largo de la longitud del esternón usando un bisturí. La profundidad de la incisión debe ser suficiente para exponer el esternón.
   2. Con cuidado, realice una esternotomía de la línea media con un par de tijeras pesadas y afiladas, evitando daños en el corazón, los pulmones o el diafragma. Si es necesario, coloque un dedo colocado entre la cara posterior del esternón y el contenido intratorácico para evitar lesiones. Maniobre un dedo en el mediastino haciendo una incisión pequeña (tamaño dedo) en el diafragma.
   3. Después de entrar en la cavidad torácica, mantenga abierta la caja torácica con un retractor auto-retenedor.
   4. Incise el pericardio usando fórceps y un par de tijeras, exponiendo el corazón latiendo. Tenga cuidado de no dañar el corazón.
   5. Identifique el ventrículo izquierdo y coloque cuidadosamente una cánula (como un angiocatéter de 14 G) a través del ápice del ventrículo. Retire la aguja, dejando el catéter en su lugar.
      NOTA: Tenga cuidado de no perforar la pared posterior del ventrículo.El retorno de sangre pulsátil desde el catéter indica que está colocado correctamente. La sangre puede ser fácilmente muestreada del animal en este punto.
   6. Después de identificar la aurícula derecha, realice una atriotomía realizando una incisión grande en la aurícula con unas tijeras para permitir la exanguinación y el escape de perfusión.
      NOTA: El isoflurano por inhalación debe continuar hasta que se confirme la muerte cardiaca. La muerte cardíaca se confirma por la falta directa de gasto cardíaco.
4. Perfundir el cochinillo usando un perfusado consistente en frío (4 ° C) de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene heparina a una concentración de 5 unidades por ml. Perfundir a 300 ml por minuto durante 5 min o hasta que la solución se aclara.
   1. Tenga cuidado de que la cánula de perfusión no se desprenda durante la perfusión. Utilice una bomba peristáltica comercialmente disponible para esta y todas las otras perfusiones.
5. Realizar una hemicraniectomía paraMover un hemisferio del cerebro para el análisis de tejido fresco.
   NOTA: Este protocolo permite la recuperación de un hemisferio de tejido cerebral fresco. El otro hemisferio es fijo. Si no se requiere tejido fresco, pase al paso 2.6.
   1. Durante este procedimiento, continúe la circulación de PBS helado a una velocidad de 50 ml por hora para asegurar que el cerebro permanezca frío.
   2. Hacer una incisión longitudinal en el cuero cabelludo a lo largo de la longitud de la sutura sagital hasta el agujero magno utilizando un bisturí. Durante el proceso, use presión firme para crear una puntuación en el cráneo. Reflejar el cuero cabelludo para exponer todo el cráneo.
   3. Usando rongeurs y comenzando en el foramen magnum, quitar el cráneo en un lado, insertando los rongeurs entre el cráneo y la duramadre, con precaución para no dañar el tejido cerebral subyacente. Quite el hueso en pedazos, usando los rongeurs para levantarlo lejos del parénquima del cerebro.
   4. Una vez que el cráneo se ha quitado, incise y quite el duUtilizando un fórceps y unas tijeras, de nuevo con precaución para no dañar el tejido cerebral subyacente.
   5. Coloque una hoja de bisturí entre los dos hemisferios para dividir cuidadosamente el cuerpo calloso.
   6. Usando una herramienta plana tal como el extremo ancho de la pinza, retrae suavemente el lóbulo frontal, cortando gradualmente los nervios craneales, trabajando anterior a posterior. En el aspecto más posterior del hemisferio, use un bisturí para cortar la médula espinal. Quitar el hemisferio en bloque.
      NOTA: El tejido cerebral no fijo es frágil. Tenga cuidado al retirar el hemisferio para evitar la interrupción del suministro de sangre del hemisferio restante.
   7. Corte el hemisferio removido. Si se indica, congelar de inmediato en 2-metilbutano enfriado a -160 ° C en un baño de nitrógeno líquido para evitar la descomposición de los tejidos, y almacenarse inmediatamente a -80 ° C para análisis posterior.
      NOTA: Se recomienda seccionar el cerebro coronalmente en incrementos de 2 mm utilizando una matriz, peroLs de seccionamiento dependerá de objetivos experimentales específicos.
6. Cambiar el perfusado a 4% de paraformaldehído (PFA). Continuar la perfusión de PFA a 300 ml por minuto durante al menos 5 min.
   ¡PRECAUCIÓN! PFA es tóxico, evite el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas. No inhale vapores de PFA.
7. Espere que el cuerpo del cochinillo se endurezca debido a la formación de reticulaciones de aldehído que se crean en el músculo. Después de completar la perfusión de PFA, retire el hemisferio restante de manera idéntica a la descrita en el paso 2.5.5.
   NOTA: El cerebro perfectamente perfundido estará pálido y completamente exsanguinated.
   1. Coloque el hemisferio restante en un recipiente pequeño con PFA al 4% fresco a 4 ° C. Mantenga el hemisferio en PFA durante 24-48 h para completar el proceso de fijación.
   2. Después de 24-48 h, mover el cerebro fijo a una solución de PBS que contiene 0,1% de azida sódica, ya que es esencial para evitar la sobre fijación. La sobre fijación podría resultar en masRey del epítopo o tinción de fondo fuerte no especıfica. La adición de azida sódica previene el crecimiento bacteriano.
      NOTA: El tejido se puede almacenar hasta un mes a 4 ° C.

3. Animales de Isoflurano (Experimental)

NOTA: Puede usarse cualquier anestesia o intervención, pero no recomendamos desflurano para la inducción por inhalación.

1. Inducción y mantenimiento de la anestesia:
   1. Realizar la anestesia utilizando una estación de trabajo de anestesia clínica equipada con un ventilador pediátrico y dispositivos de monitoreo.
   2. Después del período de 24 h de aclimatación, anestesiar los lechones con sevoflurano al 8% en 100% de O ₂ a través de la máscara de cono facial.
   3. Supervisar continuamente la oximetría de pulso, la presión arterial no invasiva, la electrocardiografía y la temperatura durante el período de inducción y en todo momento durante el procedimiento del estudio.
   4. Después de la inducción, titula sevoflurano o isofluRane a una concentración que permita una profundidad adecuada de la anestesia mientras se asegura una respiración espontánea sostenida (típicamente a una concentración de 3-4%).
   5. Colocar un catéter intravenoso periférico de 24 G en la vena marginal del oído ( Figura 1 ).
   6. Coloque el cochinillo en la posición dorsal recostada para la intubación traqueal ( Figura 2 , panel A). Utilice una cuchilla Miller # 1 o # 1.5 para facilitar la instrumentación de la hipofaringe y la intubación de la tráquea. NOTA: Durante la laringoscopia se necesita un operador y un asistente experimentados.
      1. Pida a un asistente que desplace la lengua del animal usando una gasa seca para facilitar la exposición de la laringe y la visualización de las cuerdas vocales ( Figura 2 B ).
         NOTA: La epiglotis del lechón es morfológicamente similar a la de los humanos ( Figura 2 C ). El coro vocal del cochinilloDs puede ser difícil de visualizar ya que son varios milímetros de profundidad dentro de la entrada laríngea ( Figura 2 D ).
      2. Desplazar la epiglotis: colocar la punta de la lámina de laringoscopio debajo de la epiglotis y levantar la hoja hacia arriba para exponer la laringe.
      3. Antes de colocar el tubo en la tráquea, rocíe las cuerdas vocales con 0,5 ml de lidocaína al 2% para prevenir el laringoespasmo durante el paso del tubo endotraqueal, ya que los lechones son especialmente propensos al laringoespasmo.
   7. Coloque y asegure un tubo traqueal con manguito de 3,0 mm.
      1. Asegurar sonidos bilaterales de la respiración y dióxido de carbono sostenido del final-marea usando auscultación de pecho con un estetoscopio y monitorización de EtCO ₂ .
      2. Inflar los pulmones del cochinillo a una presión continua de las vías respiratorias de 20 cm H ₂ O. Luego, inflar el manguito del tubo endotraqueal a la presión mínima requerida para evitar la fuga de aire a una presión de 20 cm H _{2 O, escuchando sobre la tráquea para identificar la fuga de aire si está presente.
         NOTA: Esto es importante para prevenir la isquemia de la mucosa durante la ventilación con presión positiva intermitente.}
      3. Normoxia y normocarbia se mantienen durante la anestesia.
   8. Comenzar la administración de isoflurano al 2% en 50% de oxígeno / 50% de aire. Titular el oxígeno para mantener la PaO ₂ de 90 - 100 mmHg. Continuar durante 3 h (o la duración experimental deseada).
   9. Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir la sequedad durante la duración de la anestesia.
2. Comenzar la cateterización de la arteria femoral después del inicio del 2% de isoflurano.
   1. Administrar antibióticos de amplio espectro antes de la incisión (cefazolina, 25 mg / kg) a través de la línea intravenosa periférica para prevenir la infección del sitio quirúrgico.
   2. Esterilice ambas ingleas usando clorhexidina teñida para asegurar un campo estéril adecuado y coloque un paño estéril apropiado ( Figura 3 B ). Como mínimo, el personal que participa en cirugía de supervivencia debe usar gorro quirúrgico, máscara, guantes estériles y protección para los ojos.
   3. Palpar el pulso femoral en el pliegue inguinal usando los dedos índice y medio.
   4. Haga una incisión craneocaudal superficial de 1,5 cm usando un bisturí ( Figura 3 C ).
   5. Disecar entre las dos cabezas del músculo gracilis utilizando un instrumento contundente, como el hemostático quirúrgico o las tijeras de punta roma ( Figura 3 D ).
      NOTA: El haz neurovascular femoral suele encontrarse entre los dos músculos y sólo profundamente. ( Figura 4A ).
   6. Usando lazos vasculares o lazos de seda, aislar la arteria en el extremo proximal y distal. Utilice el lazo para arrastrar la arteria hasta el nivel de la piel distalmente ( Figura 4 B ).
   7. MientrasColocando la tracción en el lazo proximal suficiente para interrumpir el flujo sanguíneo, realizar una pequeña arteriotomía con un par de tijeras de tenotomía.
      1. Tome precaución para no transeccionar la arteria. Una pequeña arteriotomía es suficiente. Alternativamente, use un método de aguja y alambre para acceder a la arteria ( Figura 4 C ).
      2. Una suave tracción en el empate proximal evitará la pérdida excesiva de sangre en cualquier momento durante esta parte del procedimiento. Si usa el método de aguja y alambre, pase el alambre guía (suministrado con el kit u obtenido por separado) a través de la aguja y hasta la arteria hasta 5 cm.
      3. Tenga cuidado de no avanzar el cable aún más, ya que puede causar ectopia ventricular. Retire el cable inmediatamente 1-2 cm si esto ocurre.
   8. Retire la aguja del recipiente, teniendo cuidado de dejar el cable guía en el recipiente. Pase suavemente el catéter sobre el alambre y dentro del vaso ( Figura 4 D).
      1. Utilice un catéter 3-francés, de 8 centímetros para el cateterismo de la arteria femoral. Se espera una leve resistencia cuando la punta del catéter entra por primera vez en la pared superficial del vaso.
   9. Si usa el enfoque de arteriotomía, avance el catéter o tubo de polietileno directamente en el vaso. El retorno de la sangre debe ser observado inmediatamente.
   10. Instale inmediatamente el catéter conectado a un transductor de presión. Enjuague el catéter con solución salina normal para mantener la permeabilidad del catéter.
       1. Coloque suturas para asegurar el catéter en su lugar. Cubra la incisión con gasa estéril para evitar la contaminación. Utilizar un abordaje percutáneo al cateterismo de la arteria femoral.
          NOTA: Asegúrese de que el ultrasonido sea realizado por un técnico experimentado.
3. Condiciones intra-operatorias y monitorización:
   1. Caliente activamente el lechón con un dispositivo de calentamiento de aire forzado y monitoree continuamenteRectal ( Figura 3A).
   2. Infundir fluido isotónico que contenga dextrosa (5% de dextrosa en lactato de Ringer o solución salina normal) a una tasa de mantenimiento (4 veces el peso del lechón en kilogramos, ml / h).
   3. Monitorear los signos vitales de las perturbaciones (hipotensión, arritmia, hipo / hipertermia, hipoxia)
      NOTA: En la Tabla 1 se resumen los rangos normales de signos vitales y el manejo sugerido correspondiente en el caso de anormalidades.
   4. Mediante un sistema de análisis de sangre disponible comercialmente, se miden los gases arteriales (pH arterial, pCO ₂ , pO ₂ ), electrolitos (bicarbonato, exceso / déficit de base, sodio, potasio, calcio ionizado), hemoglobina y glucosa por lo menos período. Dibujar la muestra de sangre arterial del catéter de la arteria femoral.
      NOTA: Los valores normales ácido-base y electrolitos junto con las recomendaciones para la corrección si las anomalías se ven unSe resumen en la Tabla 1 .
4. Después de 3 h de exposición al isoflurano, retire el catéter de la arteria femoral.
   1. Cuidadosamente atar la seda vascular proximal para ocluir permanentemente la arteria femoral para prevenir el sangrado. Alternativamente, utilice un clip vascular.
   2. Asegurar la hemostasia completa antes de cerrar la incisión. Irrigar la incisión con 10-20 ml de solución salina estéril para ayudar a prevenir la infección.
5. Al final del experimento, cierre la incisión cutánea con suturas simples interrumpidas utilizando un material de sutura no absorbible 3-0.
   1. Infiltre la herida usando 0,5-1 mL / kg de bupivacaína al 0,25% con epinefrina 1: 200,000 para el control del dolor. Cubra la incisión con un adhesivo estéril, quirúrgico para la piel.
      NOTA: No se requiere vestirse.
6. Suspender el anestésico y permitir que el cochinillo para despertar.
7. Quitar el tubo endotraqueal en los signos de awaKening (apertura de los ojos, intentos de pararse, patear y abrir y cerrar la boca), con signos de hemodinámica estable, oxigenación adecuada y ventilación adecuada.
8. Después de la extubación, suministre oxígeno suplementario a través del cono facial hasta que se asegure la adecuación de la oxigenación y la ventilación.
9. Administrar buprenorfina 0,05 mg / kg por vía subcutánea para controlar el dolor adicional. Alternativamente, se puede usar fentanilo transdérmico.
10. Cuando sea apropiado, regrese el lechón a su jaula de casa. No deje al cerdito desatendido hasta que haya recuperado suficiente conciencia para mantener la rectitud esternal. No devuelva un animal a una jaula con otros animales hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
    1. Calentar activamente la jaula casera privada con una luz que se calienta.
    2. Vigile de cerca al animal después de la anestesia por personal veterinario o de investigación capacitado. Proporcione el sustituto de la leche de los cochinillos.
11. Permitir que los lechones se recuperenDurante 48-72 h, dependiendo de los objetivos experimentales.
    1. Inyecte los lechones con buprenorfina subcutáneamente a una dosis apropiada, cada tres horas según sea necesario para asegurar el control del dolor, a discreción del personal de cuidado de animales experimentado para controlar el malestar post-quirúrgico en los animales.
    2. Controle los lechones cada hora durante las primeras 6 h después de la cirugía y cada 4 h después. Realizar el sacrificio de animales y la adquisición de tejidos de manera idéntica a los animales de control, descritos anteriormente.

Resultados

Se estudiaron 40 lechones (18 isoflurano, 22 de control). Los procedimientos del estudio fueron bien tolerados por todos los animales. Todos los lechones estudiados eran varones. No hubo diferencias significativas entre los grupos con respecto a la edad o el peso ( Tabla 2, Figura 5 ). Los valores medios de laboratorio durante la experimentación en el grupo isoflurano se dan en la Tabla 3 . Estos valores demuestran que el protocolo experimental posee consistencia interna y reproducibilidad, ya que teníamos múltiples técnicos realizando la cirugía a lo largo de dos años. Estos números no indican los muchos ajustes y correcciones que tuvimos que realizar durante las cirugías para mantener la hemostasia fisiológica. La retención de CO ₂ , la baja temperatura corporal central y la hipoglucemia son algunos de los muchos factores de confusión que evitamos a través de un monitoreo y ajuste integral según sea necesario.

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Figura 1:. Colocación de la Línea Periférica Intravenosa. Se coloca un catéter intravenoso de 24 G en la vena marginal del oído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Secuencia de eventos en la intubación de los cochinillos. ( A ) Los lechones se colocan en posición recostada lateral para intubación. Se colocan monitores estándar. ( B ) Un asistente desplazó la lengua de la cavidad oral mientras el laringoscopista realiza la laringoscopia. ( C ) La epiglotis es morfológicamente similar a la de un ser humano. En este gráfico, la punta de thLa cuchilla está en la vallecula. ( D ) La anatomía laríngea porcina es claramente diferente de la de los seres humanos; Las cuerdas vocales están a varios milímetros de profundidad hasta la entrada laríngea. En este gráfico, la punta de la cuchilla ha desplazado la epiglotis, exponiendo la laringe. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Método de la arteria femoral. ( A ) La temperatura del animal se mantiene usando un dispositivo de calentamiento por aire forzado. La monitorización se utiliza durante todo el procedimiento. Se prepara un amplio campo estéril con clorhexidina teñida y el animal se cubre con un paño estéril fenetrado. ( B ) La palpación en el pliegue inguinal revela el pulso femoral. ( C ) A crLa incisión de la piel aniocaudal, aproximadamente perpendicular al pliegue inguinal y aproximadamente 1,5 cm de longitud, se realiza sobre el pulso femoral. ( D ) Se consigue una disección romo para exponer el haz neurovascular femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Canalización de la arteria femoral. ( A ) De lateral a medial, el haz neurovascular contiene el nervio femoral, la arteria y la vena. ( B ) La arteria femoral se aísla usando bucles de vaso y / o sutura. La tensión sostenida en el tirante proximal evita la pérdida excesiva de sangre mientras se perfora la arteria (ver blanqueamiento del vaso). ( C ) Se utiliza una aguja para perforar la fémur aEvitando la perforación de la pared posterior de la arteria. Cuando la sangre vuelve, un alambre de guía es avanzado en la arteria a través de la aguja. ( D ) Se retira la aguja y se hace avanzar el catéter sobre el alambre de guía en la arteria femoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación del peso medio y la edad de los lechones tratados con Isoflurano y control. Las barras de error representan +/- 1 desviación estándar, con el valor de desviación estándar anotado por encima de cada barra de error.

Tabla 1: Resumen de signos vitales normales de cochinillo, ArteriAl Gas de Sangre y Valores Electrolíticos del Suero con Métodos de Corrección Sugeridos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Tabla 2: Resumen del peso medio y edad de control frente a los lechones tratados con Isoflurano. Se realizó una prueba T de dos colas no apareada, que no mostró diferencias significativas entre los dos grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Tabla 3: Signos Vitales Promedio y Valores de Laboratorio de Animales tratados con Isoflurano. Durante el curso de laLas cirugías, las desviaciones de los signos vitales y los valores del laboratorio de los rangos normales se corrigen rápidamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Discusión

Pasos críticos del protocolo / Solución de problemas

A medida que empieza el experimento, la monitorización de los signos vitales no invasivos debe comenzar con la inducción. La presión arterial, la frecuencia cardiaca, la saturación de oxígeno y la temperatura rectal se pueden obtener fácilmente y monitorear. El lechón debe estar bajo un dispositivo de calentamiento de aire para mantener la temperatura corporal adecuada, ya que estos animales pueden hacerse hipotérmicos rápidamente bajo anestesia general. La colocación rápida de un catéter intravenoso periférico permite el tratamiento de emergencias si surgen durante la inducción. Es importante monitorear continuamente el lechón, de forma no invasiva o invasiva, tanto a través del procedimiento de isoflurano como del procedimiento de sacrificio. El lechón puede experimentar desaturación de oxígeno arterial muy rápidamente durante los múltiples pasos a lo largo del protocolo, especialmente durante el manejo de las vías respiratorias y la intubación. Utilizamos sevoflurano al 8% para inducir la anestesia con el fin de replicar la práctica pediátrica humana yD inducción. Sin embargo, el isoflurano al 5% se ha utilizado con éxito y es apropiado. Dadas las diferencias en anatomía y una predisposición para el laringospasmo, el lechón puede ser difícil de intubate. Si el lechón comienza a desaturarse durante la inducción y / o el manejo de las vías respiratorias, el 100% de oxígeno y sevoflurano deben administrarse inmediatamente vía cono facial para restablecer un nivel seguro de saturación de oxígeno y una profundidad adecuada de anestesia. Tenga en cuenta que mientras que el plano de anestesia debe ser lo suficientemente profundo para permitir la intubación, la anestesia excesiva puede conducir a la apnea. Se requiere vigilancia continua con respecto a la ventilación y oxigenación del animal, con la titulación del anestésico inhalado en consecuencia. Se puede volver a intentar la intubación una vez que se restaura la oxigenación y se ha logrado una anestesia adecuada. Se puede intentar una ventilación de presión positiva a través del cono de rostro, pero normalmente no tiene éxito. Si ocurre laringoespasmo, la aplicación de la solución de lidocaína directamente alSe indica para permitir la intubación traqueal.

Los medicamentos de emergencia deben estar siempre disponibles y deben administrarse según sea necesario durante las partes críticas del protocolo para corregir las alteraciones fisiológicas. Mientras que un análisis exhaustivo de la anestesia y el uso de drogas de emergencia en los lechones está fuera del alcance de este manuscrito, Swindle "Swine in the Laboratory: Cirugía, Anestesia, Imagen y Técnicas Experimentales" es un excelente recurso. ²⁷

De manera similar, el lechón puede comenzar a desaturarse rápidamente durante el sacrificio, después de abrir la cavidad torácica durante la esternotomía de la línea media. El operador debe trabajar rápidamente pero con seguridad para exponer el corazón e insertar el angiocatheter para iniciar el PBS frío. Se necesita una perfusión completa de PBS frío (y una fijación rápida con PFA, si se indica) para prevenir el daño isquémico al cerebro.

Una vez que el lechón ha sido intubado, respiRatorio y el seguimiento del dióxido de carbono final ( Tabla 1 ). Estabilizar la oxigenación y la ventilación de la marea final del lechón titulando el soporte del ventilador mientras se mantiene la adecuada anestesia. Utilizamos ventilación mecánica para imitar lo que se utiliza en los seres humanos lo más cerca posible. La hiperoxia debe evitarse para minimizar la posibilidad de estrés oxidativo.

Los lechones de isoflurano se someten a una canulación de la arteria femoral por dos razones: monitorizar continuamente la presión arterial; Y para tomar muestras de sangre arterial para la evaluación del estado ácido-base, gases en sangre y electrolitos durante todo el procedimiento. La canulación de la arteria femoral puede ser un desafío. Por favor, vea el video para más detalles. Para los experimentos de supervivencia, este procedimiento debe realizarse en un ambiente estéril en condiciones estériles. Después de la canulación de la arteria femoral, comenzar el control horario de la sangre arterial y los electrolitos séricos, corrigiendo según sea necesario paraMantener la homeostasis ( Tabla 1 ). El lechón debe recibir fluido isotónico conteniendo dextrosa continua para mantener la glucosa en sangre adecuada. A lo largo del experimento, el animal debe ser monitoreado continuamente para la normotermia, y el calentamiento del aire forzado debe proporcionarse según sea necesario. Es igualmente importante evitar la hipotermia y la hipertermia.

Aunque este protocolo proporciona un hemisferio de cerebro "fresco" y un hemisferio de tejido neural fijo, esto puede ser fácilmente adaptado para acomodar diseños de estudio alternativos. También se pueden extraer muestras adicionales del lechón. CSF se puede obtener después de anestesiar el lechón, con o sin fluoroscopia orientación. También se puede extraer sangre del cochinillo en varias etapas del protocolo, incluyendo el catéter de la arteria femoral, así como directamente desde el ventrículo izquierdo a través del angiocatéter inmediatamente antes de la perfusión. El período de convalecencia también se puede alargar o sh Ortened, para el examen de la respuesta crónica o aguda, respectivamente.

Limitaciones de la técnica

Este protocolo y modelo son técnicamente desafiantes. Se requiere un experto investigador y un conjunto operativo totalmente suministrado, particularmente para experimentos de supervivencia. El investigador (y el asistente, para ciertas partes del protocolo) debe estar cómodo con los componentes quirúrgicos y anestésicos de este protocolo, lo que puede requerir entrenamiento y experiencia para dominar. Otras limitaciones incluyen el gasto de los lechones con respecto a los modelos de roedores, aunque el modelo de lechones es mucho menos costoso que los primates no humanos. Mientras que el costo de los lechones variará en función de la región y la granja de donde se obtienen los animales, se puede esperar que el costo por animal sea inferior a $ 500, mientras que los primates no humanos pueden ser miles de dólares por animal. En nuestra experiencia, el costo promedio por animal es típicamente alrededor de $ 200.

Jove_content "> Por último, como es el propósito del modelo de lechones imitar el cerebro humano en desarrollo, sólo deben usarse lechones neonatales, el sistema nervioso central es más vulnerable durante el período de crecimiento rápido, y en los lechones este período se extiende desde Seis semanas antes del nacimiento hasta las cinco semanas después del nacimiento ^8. El uso de lechones más viejos, más distantes de su fecha de parto, conlleva el riesgo de debilitar la relevancia clínica del modelo de los lechones Aunque existe una controversia significativa con respecto a la "equivalencia" La de un recién nacido humano, hay similitudes sorprendentes cuando se compara el desarrollo cerebral temprano postnatal entre humanos y cerdos. Al nacer, los cerebros de humanos y cerdos son 27% y 25% del peso adulto, respectivamente ¹⁴ Basado en el trabajo de Johnson Y colegas, podemos inferir que una semana de lechones es aproximadamente equivalente a un mes humano.9 Estos resultados, basados ​​en wh Ole-cerebro volumen de datos, han sido validados por el trabajo de Workman y colegas. Seleccionamos lechones de 7-14 días de edad para aproximar a un ser humano de 1-2 meses de edad. Sin embargo, puede ser prudente utilizar animales más jóvenes (1-5 días de edad) si el objetivo experimental es imitar el cenit del brote de crecimiento del cerebro de los lechones. Esto es factible, ya que los lechones pueden ser destetados al nacer. Nuestro uso del modelo de lechones se adaptará a medida que se disponga de nuevos datos con respecto a los paralelos entre el desarrollo del cerebro humano y del cerdo después del parto.

Importancia de la técnica con respecto a los métodos alternativos / existentes

El lechón posee sorprendentes similitudes con los recién nacidos humanos, incluyendo paralelos críticos en el desarrollo del cerebro y respuestas fisiopatológicas. Por lo tanto, es un modelo de mamífero clínicamente relevante y el estudio de prueba de concepto indica que el lechón es un modelo adecuado para el estudio de la neurotoxicidad anestésicaEl modelo está diseñado para investigar, con autoridad científica, la extensión y el mecanismo de AIDN minimizando las preocupaciones de que los factores de confusión, como la hipoxia o la hipercarbia, son Causando daño neurológico que podría ser malinterpretado como inducido por la anestesia Para lograr esto, el lechón es tratado con las mismas condiciones quirúrgicas y anestésicas perioperatorias y la monitorización experimentada por pacientes pediátricos.

Direcciones y aplicaciones futuras después de dominar la técnica

Avanzando, los lechones también son muy susceptibles a las pruebas neurocognitivas [ ^17] . Este atributo permitirá una evaluación compleja y exhaustiva del resultado neurocognitivo después de la exposición anestésica en futuros experimentos. Cabe destacar también que en el entorno clínico, los niños suelen someterse a anestesiaRa procedimiento fisiológicamente estresante (cirugía). Las interacciones entre la anestesia y la inflamación posquirúrgica, así como la lesión neuronal resultante y / o la toxicidad (como se observa en roedores y primates) merecen mayor exploración y consideración significativa. El lechón neonatal proporciona un modelo de referencia único y clínicamente relevante para los efectos de los anestésicos en el cerebro en desarrollo sin la influencia confusa de la cirugía (imitando escenarios clínicos comunes en niños). El impacto de diferentes tipos de cirugía u otros factores de confusión (isquemia, lesión cerebral, predisposición genética, etc. ) pueden ahora ser probados con fiabilidad utilizando este modelo.

En laboratorio, planeamos utilizar múltiples métodos electrofisiológicos y electroquímicos para investigar más los mecanismos de anestesia y AIDN en circuitos neurales intactos. Estas técnicas incluyen la medición in vivo de la actividad del neurotransmisor, grabaciones de parche de sujeción de células completas, neuroimagen, yInvestigaciones neurofisiológicas en cortes cerebrales. Con respecto a la neurociencia en el cerebro inmaduro, los lechones son más relevantes para los seres humanos que los modelos murinos con muy pocos de los inconvenientes presentes con los primates no humanos. Con un mayor desarrollo, los lechones pueden ser el modelo ideal para la investigación de la neurología del desarrollo humano.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liqui-Wean	Milk Specialities	454836
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask	VetEquip	921428
Masterflex L/S Peristaltic Pump	Cole-Parmer	EW-77916-20	Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved
Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft	Cole-Parmer	EW-96410-24
14 G angiocatheter	Becton-Dickson	381164
10x PBS	Thermo-Fisher Scientific
Paraformaldehyde powder	Sigma-Aldrich	P6148-5KG	Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased.
2-methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631-4L
Needle holder	Teleflex	152720
Right angle clamp	Teleflex	496217
Rongeurs	Teleflex	028120
Tenotomy scissors	Teleflex	423480
Stitch scissors	Teleflex	423440
McPherson Tying Forceps	Teleflex	425200
Adson Tissue Forceps	Teleflex	181223
3-0 nylon suture	Medline	ETH627H
Integra SL Anesthesia Workstation	DRE Veterinary	2350	This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.
Laryngoscope handle	Teleflex	8710000
Miller 1 Laryngoscope blade	Teleflex	2216100
Bair Hugger	3M	750
Bair Hugger Torso Blanket	3M	540
iStat Handheld	Abbott Point of Care	300	Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used
iStat Cartridges	Abbott Point of Care	CG8+
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive	Ethicon	DNX6
LMA Laryngotracheal Atomization Device	Teleflex	MAD720	A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube	Teleflex	5-10106	This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment
Pediatric Intubation Stylet	Smiths Medical	100/120/100
24 G angiocatheter	Becton-Dickson	381112
#10 Disposable Scalpel	Ted Pella, Inc	549-9-10
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter)	Cook Medical	C-PMSY-300-FA	Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used
Intramedic PE90 Polyethylene tubing	Fisher Scientific	14-170-12D
Monoject Blunt Cannula	VWR International	15141-144