Utilisation d'un modèle Piglet pour l'étude de la neurotoxicité du développement induite par l'anesthésie (AIDN): une approche de la neurologie translationnelle

Résumé

La recherche sur la neurotoxicité du développement induite par l'anesthésie (AIDN) s'est concentrée sur les rongeurs, qui ne sont pas largement applicables aux humains. Les modèles de primates non humains sont plus pertinents, mais ils sont coûteux et difficiles à utiliser pour l'expérimentation. Le porcelet, en revanche, est un modèle animal cliniquement pertinent, idéal pour l'étude de la neurotoxicité anesthésiante.

Résumé

L'anesthésie ne peut être évitée dans de nombreux cas lorsque la chirurgie est nécessaire, en particulier chez les enfants. Des recherches récentes chez les animaux ont soulevé des doutes quant à l'exposition de l'anesthésie à une apoptose neuronale, connue sous le nom de neurotoxicité de développement induite par l'anesthésie (AIDN). En outre, certaines études cliniques chez les enfants ont suggéré que l'exposition à l'anesthésie pourrait entraîner des déficits neurodéveloppementaux plus tard dans la vie. Néanmoins, un modèle animal idéal pour l'étude préclinique n'a pas encore été développé. Le porcelet néonatal représente un modèle précieux pour l'étude préclinique, car ils partagent un nombre frappant de similarités de développement avec les humains.

L'anatomie et la physiologie des porcelets permettent la mise en place de conditions périopératoires humaines rigoureuses dans les procédures de survie et non-survie. Le cathétérisme de l'artère fémorale permet une surveillance étroite, permettant ainsi une correction rapide de toute déviation des signes et chimies vitales du porcelet. jeDe plus, il existe de multiples similitudes de développement entre les porcelets et les nouveau-nés humains. Les techniques requises pour utiliser des porcelets pour l'expérimentation nécessiteront une expérience à maîtriser. Un anesthésiste pédiatrique est un membre critique de l'équipe d'enquête. Nous décrivons, dans un sens général, l'utilisation appropriée d'un modèle de porcelet pour l'étude du développement neurologique.

Introduction

Chaque année, des millions d'enfants aux États-Unis reçoivent une anesthésie générale, dont beaucoup sont moins de 4 ans ¹ . La neurotoxicité du développement induite par l'anesthésie (AIDN) est devenue l'objet de la recherche en anesthésie pédiatrique, car il est devenu impératif de comprendre les effets de l'anesthésie sur les cerveaux immatures. Des recherches antérieures ont montré que les anesthésiques couramment utilisés, comme l'isoflurane, peuvent provoquer une apoptose neuronale accrue dans le cerveau des jeunes animaux. Les études sur les enfants ont donné des résultats équivoques ² . La compréhension de la pathogenèse de l'AIDN, l'identification de cibles thérapeutiques potentielles pour sa prévention ou son amélioration, et la description des schémas anesthésiques les plus sûrs disponibles sont devenus des objectifs urgents de la communauté d'anesthésie pédiatrique. L'objectif principal de cette étude était de développer un modèle animal optimal et une méthode pour quantifier les effets des anesthésiques sur le cerveau en développement et stimuler soigneusementA conçu une enquête sur la sécurité des anesthésiques actuellement largement utilisés.

Dans une revue systématique récente du corps actuel de la littérature préclinique sur l'AIDN, les auteurs ont noté une hétérogénéité méthodologique significative dans plus de 900 études ³ . Beaucoup ont considéré que cela nécessitait un modèle préclinique cliniquement pertinent et bien conçu, qui n'existe pas encore pendant plusieurs années de recherche sur ce sujet. La plupart des modèles de rongeurs, par nécessité, utilisent une approche qui ne permet pas une surveillance physiologique rigoureuse, un prélèvement sanguin ou une ventilation mécanique. Étant donné que le cerveau est exquisement sensible aux dérangements physiologiques, il est difficile de compter sur les résultats de ces modèles. Un objectif principal pour le développement de ce modèle était de le concevoir de telle sorte que toutes les variables physiologiques telles que les paramètres du gaz sanguin, la température corporelle, les paramètres respiratoires, etc. soient surveillées et corrigées si nécessaire.

En outre, parce que la neurotoxicité de l'anesthésie dépend probablement du progrès du cerveau au moment de l'exposition, un modèle animal devrait être choisi pour mieux imiter le développement et la structure du cerveau humain néonatal, afin de maximiser La pertinence translationnelle des résultats ⁴ . Le modèle de porcelet translationnel fournit le niveau de pertinence clinique recherché dans ces critiques et éditoriaux, car il est conçu pour répondre à ce besoin de données précliniques pertinentes qui peuvent éclairer les futures études cliniques.

L'isoflurane, un agoniste des récepteurs GABA de type A (GABA _A ) et un antagoniste faible des récepteurs NMDA, est un anesthésique inhalé couramment utilisé dans la pratique clinique dans le monde entier. Les anesthésiques comme l'isoflurane ont été considérés comme sécurisés tant qu'ils n'induisent pas une hypotension ou une hypoxie; Pourtant, des effets plus subtils peuvent survenir. Lorsque le cerveau est exposé à une anesthésie générale, l'équilibre de GABA aLe gonisme et l'antagonisme NMDA sont perturbés, entraînant des altérations dans l'architecture cellulaire, la connectivité et la fonction. En outre, alors que GABA est généralement un neurotransmetteur inhibiteur, il est connu d'être excitateur dans les cerveaux immatures ⁵ . Précisément lorsque la transition de GABA de l'excitation à l'inhibition se produit n'est pas bien comprise et probablement dépendante des espèces.

Lorsqu'un déséquilibre entre l'entrée excitatrice et inhibitrice dans le cerveau se produit au cours de la soi-disant «poussée de croissance du cerveau», la dysrégulation excitotoxique résultante des voies moléculaires critiques peut conduire à un neurodéveloppement anormal, comme la neurodégénérescence apoptotique. En plus d'une apoptose accrue, le stress oxydatif et l'inflammation peuvent également être induits, alors que la prolifération des cellules neuronales, la migration neuronale et l'arborisation axonale sont supprimées ou dysregulées ⁶ . Le résultat net est une perturbation neurocognitive qui peut persister dans un adulBonne qualité ²

Pour mesurer directement les effets neurotoxiques de l'isoflurane sur les jeunes mammifères, on utilise des porcelets néonatals. Les porcelets partagent plus de similitudes du SNC avec les humains que tout autre mammifère, et en tant que telles, leurs similitudes neurodéveloppementales et neuroanatomiques en font un animal idéal pour un modèle de mammifère cliniquement pertinent de l'AIDN. Les humains et les porcelets possèdent des cerveaux gyrencéphaliques, partageant des similitudes dans le caractère et la distribution du cerveau gyri, de la matière grise et de la matière blanche. L'hippocampe du porcelet, les ganglions basaux et le tronc cérébral sont également topographiquement similaires à ceux des humains ⁷ . En termes de développement, les porcelets sont l'un des rares mammifères non humains qui subissent une croissance du cerveau périnatal et une myélinisation ⁸ . Dans l'utérus, le cerveau humain et le cerveau des porcelets subissent une croissance significative pendant la fin de la fin du trimestre. En corrélation, à la naissance, les cerveaux humains et de porcs sont respectivement de 27% et 25% des cerveaux adultes. L'imagerie par résonance magnétique a révélé qu'un cerveau de porcelet d'une semaine est approximativement équivalent à un cerveau humain d'un mois en termes de maturation neuronale et d'arborisation dendritique ⁹ . En outre, le léopard et le cerveau humain partagent de nombreuses similitudes en ce qui concerne les modèles de développement neurologique. Par exemple, l'expression et la séquence d'ARNm de la réeline ¹⁰ , la répartition topographique des neurones 5-HT ¹¹ et la fermeture du tube neural ¹² sont toutes parallèles à celles observées chez l'homme. En outre, il existe une grande homologie entre les génomes des porcelets et des humains ¹³ .

La pertinence d'un modèle animal doit être comprise dans le contexte de la pathologie humaine, en particulier en ce qui concerne la maturité du cerveau et la pathologie du bébé humain. La plupart des études existantes sur la toxicité de l'anesthésie utilisent un modèle de rongeur, dont quelques-uns utilisent des personnes non humainesModèles de primates. Cependant, les rongeurs et les primates peuvent ne pas être les animaux idéaux pour enquêter sur l'AIDN.

Bien que largement utilisés, les cerveaux des rongeurs sont très différents de ceux des humains tout au long du développement. Plus particulièrement, les rongeurs possèdent des cerveaux lissencephaliques (ou lisses). Le cerveau des rongeurs manque des gyri et des sondes qui sont caractéristiques de plus d'organismes complexes neurologiquement complexes. Le cerveau des rongeurs subit également une poussée post-natale de croissance du cerveau ¹⁴ , différente des humains et des porcelets. On a observé qu'il existe des variations dans la vulnérabilité de différentes régions du cerveau à l'anesthésie inhalée ¹⁵ . Par conséquent, il devrait être important que le modèle animal pour l'étude de l'AIDN possède un cerveau neurodynamique et neuroanatomiquement semblable à celui d'un humain, afin de mieux modeler les altérations cérébrales induites par l'anesthésie qui sont susceptibles d'être observées chez les patients pédiatriques. Comme décrit précédemment, les porcelets possèdent un cerveau que jeC'est très mieux adapté à ce rôle. En outre, les formes communes de tests neurocognitifs des rongeurs, tels que l'apprentissage spatial et la mémoire évalués dans le labyrinthe d'eau Morris, ne sont pas directement pertinentes ou comparables aux évaluations neurocognitives chez les jeunes enfants ¹⁶ . L'un des avantages de l'utilisation de porcelets pour les neurosciences du développement est qu'ils sont extrêmement propices aux tests neurocognitifs, même à un âge précoce. De nombreux tests neurocognitifs qui sont considérés comme utiles pour d'autres espèces de mammifères ont été utilisés avec succès et validés chez les porcs. Bien que ce soit encore un domaine en évolution, l'évaluation neurocognitive chez les porcelets comprend des tests plus complexes qui imitent les déficits humains, tels qu'un test moteur à faisceau incliné ^{17 , 18} et un test de conscience spatiale miroir ¹⁹ . Le test du moteur avec le faisceau incliné, dans le cadre d'une étude traumatique du traumatisme cérébral chez les porcelets, présente une grande fiabilité dans l'évaluationDe la fonction moteur. Le test du miroir démontre la mémoire du milieu environnant, plus la reconnaissance et l'utilisation d'une image réfléchie pour rechercher une récompense alimentaire.

D'autre part, les primates non humains peuvent être un modèle plus approprié pour les études d'anesthésie pédiatrique, mais il existe un certain nombre de facteurs prohibitifs, y compris le coût et la difficulté d'utilisation. En outre, ils sont extrêmement sensibles aux conditions précoce d'élevage, en particulier au stress et à la séparation maternelle ²⁰ . Les facteurs importants pour l'étude de l'AIDN, tels que les modulateurs allostériques, les affinités récepteur-ligand, les modifications post-traductionnelles, les compositions de sous-unités de récepteur et les variantes alternatives d'épissage, sont inconnus dans le cas des primates. C'est parce que les gènes pertinents à de tels concepts n'ont pas été clonés. En revanche, ils ont été clonés dans des cochons. En tant que tel, seul un travail limité a été réalisé dans des primates non humains ^{21 , 22} .

Le modèle de porcelet illustre les avantages des modèles de primates et de nouilles non humains: il est rentable, facile à utiliser par rapport aux études de primates non humains et est neuroanatomiquement et neurophysiologiquement similaire au cerveau humain pédiatrique. L'utilisation de la recherche sur les porcelets dans les neurosciences a augmenté ces dernières années, y compris un certain nombre d'études qui ont examiné les conditions neuroinflammatoires pédiatriques. Les effets de l'infection virale respiratoire sur l'hippocampe et l'apprentissage spatial ²³ , la réduction de la mort de la cellule cérébrale après un accident vasculaire cérébral ²⁴ , la neurogénèse suite à une lésion cérébrale traumatique ²⁵ et l'activité enzymatique lors des convulsions ²⁶ sont quelques-unes des études qui ont utilisé des porcelets néonatals. Cette littérature substantielle et croissante donne de la force à l'adéquation et à la durabilité du modèle de porcelet cliniquement pertinent et hautement reproductible pour l'étude de l'anesthésieLa neurotoxicité induite par la sia.

Protocole

Les porcelets sains et domestiques ( Sus scrofa) sont obtenus auprès d'une ferme agréée par le Comité d'aide et d'aide aux animaux institutionnels de l'Ohio State University (IACUC). Toutes les expérimentations animales sont effectuées conformément à la politique de l'IACUC de l'Ohio State University, après approbation du protocole.

1. Manutention des animaux et des animaux

1. Utilisez des porcelets mâles dans cette expérience pour éliminer les effets de confusion potentiels du sexe. NOTE: Si les objectifs expérimentaux incluent l'évaluation des effets de l'expérience sur les animaux pendant la période de croissance maximale du cerveau, n'utilisez pas de porcelets de plus de 14 jours.
2. Prévoir que les porcelets arrivent dans le vivarium au moins 24 heures avant l'expérimentation pour permettre l'acclimatation à l'environnement.
   REMARQUE: les techniciens vétérinaires formés supervisés par des vétérinaires autorisés fournissent des soins courants aux animaux.
   1. Gardez les porcelets dans des cages individuelles contrôlées par la température et donnez une alimentationNally complete, remplacement commercial du lait de porcelet ad libitum. Fournir aux animaux une couverture et un jouet. Surveillez en permanence la température dans les enclos d'animaux.
3. Pour cette étude préliminaire de faisabilité, ont utilisé 18 porcelets pour le bras isoflurane et 22 porcelets pour le bras témoin. Effectuez des calculs de taille d'échantillon basés sur la conception de l'étude lorsque cela est possible. Aléatoirez les porcelets disponibles pour le contrôle ou le groupe d'exposition pour la durée d'exposition appropriée. De l'expérience, même avec des chercheurs multiples, s'attendre à pouvoir effectuer pas plus de 2 expériences par jour (2 animaux au total).

2. Contrôle des animaux

1. Ne pas effectuer d'intervention expérimentale sur les animaux témoins.
2. Induire une anesthésie générale profonde via un masque à cône pour la perfusion et la procédure de collecte des tissus. Plus précisément, après la période d'acclimatation de 24 heures, anesthésier les porcelets avec 5% d'isoflurane ou 8% de sévoflurane dans 100% d'oxygène <Em> via un masque à cône. N'utilisez pas de desflurane pour l'induction.
   NOTE: Le temps entre l'induction de l'anesthésie et l'établissement d'une perfusion de PBS froid devrait être aussi court que possible. Les techniciens expérimentés peuvent terminer ce processus en moins de 5 min.
   1. Confirmer une profondeur d'anesthésie adéquate par manque de réflexe de pincement par un clamp chirurgical.
   2. Pour éviter les insultes hypoxiques / ischémiques au cerveau, surveiller le porcelet en utilisant un oxymètre de pouls pour assurer le maintien d'une oxygénation, d'une ventilation et d'un débit cardiaque adéquats jusqu'à ce que la perfusion de solution salée tamponnée au phosphate froid (PBS) commence.
      REMARQUE: Pour fournir une protection supplémentaire contre les dommages aux tissus, emballez l'animal (y compris la tête) dans la glace après induction de l'anesthésie.
3. Effectuer une perfusion transcardiaque.
   REMARQUE: parce que le paraformaldéhyde est utilisé, la procédure de perfusion doit être effectuée sous une hotte aspirante ou sur une table de tir descendante.
   1. Faire un craniocaudal iNcision sur toute la longueur du sternum à l'aide d'un scalpel. La profondeur de l'incision doit être suffisante pour exposer le sternum.
   2. Effectuez soigneusement une sternotomie de la ligne médiane avec une paire de ciseaux lourds et épais, en évitant les dommages au cœur, aux poumons ou au diaphragme. Si nécessaire, placez un doigt entre l'aspect postérieur du sternum et le contenu intrathoracique pour éviter les blessures. Manipuler un doigt dans le médiastin en effectuant une petite incision (taille du doigt) dans le diaphragme.
   3. Après avoir pénétré dans la cavité thoracique, maintenez la cage thoracique ouverte en utilisant un rétracteur auto-rétention.
   4. Incisez le péricarde à l'aide de pince et une paire de ciseaux, en exposant le cœur battant. Faites attention de ne pas blesser le cœur.
   5. Identifiez le ventricule gauche et placez soigneusement une canule (comme un angiocathete 14 G) dans le sommet du ventricule. Retirez l'aiguille, laissant le cathéter en place.
      REMARQUE: Soyez prudent pour ne pas perforer la paroi postérieure du ventricule.Le retour de sang pulsatile du cathéter indique qu'il est correctement placé. Le sang peut facilement être prélevé sur l'animal à ce stade.
   6. Après avoir identifié l'oreillette droite, effectuer une atriotomie en effectuant une grande incision dans l'oreillette avec des ciseaux pour permettre l'exsanguination et l'échappement du perfusat.
      REMARQUE: L'isoflurane par inhalation doit être poursuivie jusqu'à ce que la mort cardiaque soit confirmée. La mort cardiaque est confirmée par un manque de débit cardiaque observé directement.
4. Perfuser le porcelet en utilisant un perfusique composé de froid (4 ° C) de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) contenant de l'héparine à une concentration de 5 unités par ml. Perfuser à 300 mL par minute pendant 5 min ou jusqu'à ce que la solution soit claire.
   1. Veillez à ce que la canule de perfusion ne soit pas délogée pendant la perfusion. Utilisez une pompe péristaltique disponible dans le commerce pour cette et toutes les autres perfusions.
5. Effectuer une hémicraniectomie à reDéplacer un hémisphère du cerveau pour analyser les tissus frais.
   NOTE: Ce protocole permet de récupérer un hémisphère de tissu cérébral frais. L'autre hémisphère est réparé. Si aucun tissu frais n'est nécessaire, passez à l'étape 2.6.
   1. Au cours de cette procédure, continuez la circulation de PBS glacé à une vitesse de 50 mL par heure pour vous assurer que le cerveau reste froid.
   2. Faire une incision longitudinale dans le cuir chevelu sur toute la longueur de la suture sagittale jusqu'à ce que le foramen magnum utilise un scalpel. Pendant le processus, utilisez une pression ferme pour créer un score dans le crâne. Réfléchissez le cuir chevelu pour exposer tout le crâne.
   3. À l'aide de rongeurs et à partir du foramen magnum, retirez le crâne d'un côté en insérant les rongeurs entre le crâne et la dure-mère, en prenant soin de ne pas blesser le tissu cérébral sous-jacent. Retirer l'os en morceaux, en utilisant les rongeurs pour le retirer du parenchyme du cerveau.
   4. Une fois que le crâne a été enlevé, cirez et enlevez le duRa mater en utilisant des pince et des ciseaux, à nouveau en prenant soin de ne pas nuire au tissu cérébral sous-jacent.
   5. Placez une lame de scalpel entre les deux hémisphères afin de répartir soigneusement le corpus callosum.
   6. À l'aide d'un outil plat tel que l'extrémité large de la poignée de la pince, retirez doucement le lobe frontal, en séparant progressivement les nerfs crâniens, en travaillant antérieurement à la postérieure. À l'aspect le plus postérieur de l'hémisphère, utiliser un scalpel pour couper la moelle épinière. Retirez l'hémisphère en bloc.
      NOTE: Le tissu cérébral non fixé est fragile. Soyez prudent lorsque vous retirez l'hémisphère afin d'éviter toute perturbation de l'approvisionnement en sang de l'hémisphère restante.
   7. Sectionz l'hémisphère enlevé. Si cela est indiqué, il faut immédiatement congeler du 2-méthylbutane refroidi à -160 ° C dans un bain d'azote liquide pour éviter la dégradation des tissus et immédiatement stocké à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
      REMARQUE: Nous recommandons de sectionner le cerveau par voie coronaire dans des incréments de 2 mm en utilisant une matrice, mais un détail spécifiqueLa section des sections dépendra des objectifs expérimentaux spécifiques.
6. Changer le perfusat à 4% de paraformaldéhyde (PFA). Poursuivre la perfusion de PFA à 300 mL par minute pendant au moins 5 min.
   MISE EN GARDE! Le PFA est toxique, évitez tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses. Ne pas inhaler les fumées de PFA.
7. Attendez-vous à ce que le corps du porcelet se raidisse en raison de la formation de liaisons aldéhyde créées dans les muscles. Une fois la perfusion de PFA terminée, retirer l'hémisphère restant de la même manière que celle décrite à l'étape 2.5.5.
   REMARQUE: Le cerveau correctement perfusé sera pâle et complètement exsanguiné.
   1. Placez l'hémisphère restant dans un petit récipient avec 4% de PFA frais à 4 ° C. Gardez l'hémisphère en PFA pendant 24 à 48 heures pour compléter le processus de fixation.
   2. Après 24-48 h, déplacez le cerveau fixé à une solution de PBS contenant 0,1% d'azide de sodium, car il est essentiel d'éviter la sur-fixation. La sur-fixation pourrait entraîner un masRoi de l'épitope ou forte coloration de fond non spécifique. L'addition d'azide de sodium empêche la croissance bactérienne.
      REMARQUE: Le tissu peut être stocké jusqu'à un mois à 4 ° C.

3. Isoflurane (Expérimental) Animaux

NOTE: Toute anesthésie ou intervention peut être utilisée, mais nous ne recommandons pas le desflurane pour l'induction par inhalation.

1. Induction et entretien de l'anesthésie:
   1. Effectuer l'anesthésie en utilisant un poste de travail d'anesthésie clinique équipé d'un ventilateur pédiatrique et de dispositifs de surveillance.
   2. Après la période d'acclimatation de 24 h, anesthésier les porcelets avec 8% de sévoflurane dans 100% O ₂ via un masque à cône.
   3. Surveiller de façon continue l'oxymétrie de pouls, la tension artérielle non invasive, l'électrocardiographie et la température pendant la période d'induction et en tout temps pendant la procédure d'étude.
   4. Après l'induction, titrer le sevoflurane ou l'isofluRane à une concentration qui permet une profonde profondeur d'anesthésie tout en assurant une respiration spontanée soutenue (typiquement à une concentration de 3-4%).
   5. Placez un cathéter intraveineux périphérique 24 G dans la veine marginale de l'oreille ( Figure 1 ).
   6. Placez le porcelet dans la position couchée dorsale pour l'intubation trachéale ( Figure 2 , panneau A). Utilisez une lame Miller # 1 ou # 1.5 pour faciliter l'instrumentation de l'hypopharynx et l'intubation de la trachée. REMARQUE: Un opérateur et un assistant expérimentés sont nécessaires pendant la laryngoscopie.
      1. Demandez à un assistant de déplacer la langue de l'animal à l'aide d'une gaze sèche pour faciliter l'exposition du larynx et la visualisation des cordes vocales ( figure 2 B ).
         NOTE: L'épiglotte de porcelet est morphologiquement similaire à celle des humains ( figure 2 C ). La corne vocale du porceletLes ds peuvent être difficiles à visualiser car ils ont plusieurs millimètres de profondeur dans l'entrée du larynx ( figure 2 D ).
      2. Déplacez l'épiglotte: placez la pointe de la lame du laryngoscope sous l'épiglotte et soulevez la lame vers le haut pour exposer le larynx.
      3. Avant de placer le tube dans la trachée, pulvériser les cordes vocales avec 0,5 ml de lidocaïne à 2% pour prévenir le laryngospasme pendant le passage du tube endotrachéal, car les porcelets sont particulièrement enclins au laryngospasme.
   7. Placez et fixez un tube trachéal à manchette de 3,0 mm.
      1. Assurez-vous que les sons biliaires de la respiration et le dioxyde de carbone à la marée montante sont soutenus par l'auscultation thoracique avec un stéthoscope et une surveillance de l'EtCO ₂ .
      2. Gonfler les poumons du porcelet jusqu'à une pression continue des voies aériennes de 20 cm H ₂ O. Ensuite, gonfler la manchette du tube endotrachéal à la pression minimale requise pour éviter une fuite d'air à une pression de 20 cm H _{2 O, écoutant la trachée pour identifier la fuite d'air si présent.
         REMARQUE: Ceci est important pour prévenir l'ischémie muqueuse pendant la ventilation par pression positive intermittente.}
      3. La normoxie et la normocarbie sont maintenues pendant l'anesthésie.
   8. Commencer l'administration de 2% d'isoflurane dans 50% d'oxygène / 50% d'air. Titrer de l'oxygène pour maintenir PaO ₂ de 90 - 100 mmHg. Continuer pendant 3 h (ou la durée expérimentale souhaitée).
   9. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse pendant toute la durée de l'anesthésie.
2. Commencez le cathétérisme de l'artère fémorale après l'initiation de 2% d'isoflurane.
   1. Administrer une pré-incision des antibiotiques à large spectre (cefazoline, 25 mg / kg) par voie intraveineuse périphérique pour prévenir l'infection du site chirurgical.
   2. Stériliser les deux aines en utilisant de la chlorhexidine teinté pour assurer un champ stérile approprié et placer un drap stérile approprié ( Figure 3 B ). Au minimum, le personnel participant à la chirurgie de survie doit porter un capuchon chirurgical, un masque, des gants stériles et une protection oculaire.
   3. Palper la pouls fémorale au pli inguinal en utilisant les doigts de l'index et du milieu.
   4. Faire une incision superficielle, 1,5 cm, craniocaudale à l'aide d'un scalpel ( Figure 3 C ).
   5. Dissection entre les deux têtes du muscle gracilis à l'aide d'un instrument émoussé, comme un hémostatique chirurgical ou des ciseaux à pointe oblique ( Figure 3 D ).
      NOTE: Le faisceau neurovasculaire fémoral se trouve typiquement entre les deux muscles et est profondément profond. ( Figure 4 A ).
   6. En utilisant des boucles vasculaires ou des liens de soie, isoler l'artère à l'extrémité proximale et distale. Utilisez la boucle pour extraire l'artère jusqu'au niveau de la peau distalement ( Figure 4 B ).
   7. Tandis quePlacer une traction sur le lien proximal suffisant pour interrompre le flux sanguin, faire une petite artériotomie avec une paire de ciseaux de tenotomie.
      1. Prenez soin de ne pas transposer l'artère. Une petite artériotomie est suffisante. Alternativement, utilisez une approche à l'aiguille et au fil pour accéder à l'artère ( Figure 4 C ).
      2. Une traction douce sur la cravate proximale empêchera la perte de sang excessive à n'importe quel moment pendant cette partie de la procédure. Si vous utilisez l'approche aiguille et fil, passez le fil de guidage (fourni avec le kit ou obtenu séparément) à travers l'aiguille et dans l'artère jusqu'à 5 cm.
      3. Soyez prudent pour ne pas avancer le fil, car il peut provoquer une ectopie ventriculaire. Retirer le fil immédiatement 1-2 cm si cela se produit.
   8. Retirez l'aiguille du récipient, en prenant soin de laisser le fil guide dans le récipient. Passez doucement le cathéter sur le fil et dans le récipient ( figure 4 D).
      1. Utilisez un cathéter à 3 centimètres de 3 francs pour le cathéter de l'artère fémorale. Attendez-vous à une résistance douce lorsque la pointe du cathéter entre dans la paroi superficielle du vaisseau.
   9. Si vous utilisez l'approche artériotomique, avancez le cathéter ou les tubes en polyéthylène directement dans le récipient. Le retour du sang doit être observé immédiatement.
   10. Fixez immédiatement le cathéter à un transducteur de pression. Rincer le cathéter avec une solution saline normale pour maintenir la perméabilité du cathéter.
       1. Placez les sutures pour fixer le cathéter en place. Couvrir l'incision avec de la gaze stérile pour éviter toute contamination. Utiliser une approche percutanée du cathétérisme de l'artère fémorale.
          REMARQUE: Assurez-vous que l'échographie est effectuée par un technicien expérimenté.
3. Conditions et suivi intra-opératoires:
   1. Réchauffer activement le porcelet avec un dispositif de réchauffement par air forcé et surveiller en permanenceTempérature rectale ( figure 3 A ).
   2. Infuser le fluide isotonique contenant du dextrose (5% de dextrose dans le lactate de Ringer ou la solution saline normale) au taux d'entretien (4 fois le poids du porcelet en kilogrammes, mL / h).
   3. Surveiller les signes vitaux pour les perturbations (hypotension, arythmie, hypo / hyperthermie, hypoxie)
      NOTE: Les plages de signes vitaux normaux et la gestion suggérée correspondante dans le cas d'anomalies sont résumées dans le tableau 1 .
   4. En utilisant un système d'analyse sanguine disponible dans le commerce, mesurez les gaz sanguins artériels (pH artériel, pCO ₂ , pO ₂ ), les électrolytes (bicarbonate, excès / déficit de base, sodium, potassium, calcium ionisé), l'hémoglobine et le glucose au moins une fois par heure au cours de l'expérimentation période. Dessiner un échantillon de sang artériel du cathéter de l'artère fémorale.
      REMARQUE: valeurs normales d'acide-base et d'électrolyte, ainsi que des recommandations de correction si des anomalies sont observéesRésumée dans le tableau 1 .
4. Après 3 h d'exposition à l'isoflurane, retirer le cathéter de l'artère fémorale.
   1. Attachez soigneusement la soie vasculaire proximale pour obstruer de façon permanente l'artère fémorale pour éviter les saignements. Alternativement, utilisez un clip vasculaire.
   2. Assurez-vous d'une hémostase complète avant de fermer l'incision. Irriguez l'incision avec 10 à 20 ml de solution saline stérile pour prévenir la contamination.
5. À la fin de l'expérience, fermez l'incision cutanée avec des sutures simples et interrompues en utilisant un matériau de suture 3-0 non absorbable.
   1. Infiltrer la plaie en utilisant 0,5-1 mL / kg de bupivacaïne à 0,25% avec 1: 200 000 épinéphrine pour le contrôle de la douleur. Revêtir l'incision avec un adhésif chirurgical stérile et chirurgical.
      REMARQUE: Aucun dressing n'est requis.
6. Arrêtez l'anesthésie et laissez le porcelet vous réveiller.
7. Retirer le tube endotrachéal sur les signes de l'awaKening (ouverture des yeux, tentative de se tenir debout, coups de pied et ouverture et fermeture de la bouche), avec des signes d'hémodynamique stable, d'une oxygénation adéquate et d'une ventilation adéquate.
8. Après l'extubation, fournir de l'oxygène supplémentaire via le cône jusqu'à ce que l'adéquation de l'oxygénation et de la ventilation soit assurée.
9. Administrer de la buprénorphine 0,05 mg / kg par voie sous-cutanée pour un contrôle supplémentaire de la douleur. Alternativement, le fentanyl transdermique peut être utilisé.
10. Le cas échéant, remettez le porcelet dans sa cage à domicile. Ne laissez pas le porcelet sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir le recul sternal. Ne ramène pas un animal à une cage avec d'autres animaux jusqu'à ce qu'il soit complètement récupéré de l'anesthésie.
    1. Réchauffez activement la cage de maison privée avec un feu de réchauffement.
    2. Suivre attentivement l'animal après anesthésie par un personnel vétérinaire ou de recherche formé. Fournir le remplacement du lait de porcelet.
11. Permettre aux porcelets de récupérerPour 48 à 72 h, selon les objectifs expérimentaux.
    1. Injecter des porcelets avec de la buprénorphine par voie sous-cutanée à une dose appropriée, toutes les trois heures nécessaires pour assurer le contrôle de la douleur, à la discrétion du personnel de soins animal expérimenté pour contrôler l'inconfort postopératoire chez les animaux.
    2. Surveiller les porcelets toutes les heures pendant les 6 premières heures après la chirurgie et toutes les 4 h par la suite. Effectuer des sacrifices d'animaux et l'achat de tissus de manière identique pour contrôler les animaux, décrits ci-dessus.

Résultats

Quarante porcelets ont été étudiés (18 isoflurane, 22 témoins). Les procédures d'étude ont été bien tolérées par tous les animaux. Tous les porcelets étudiés étaient des hommes. Il n'y avait pas de différence significative entre les groupes par rapport à l'âge ou au poids ( tableau 2, figure 5 ). Les valeurs moyennes de laboratoire lors de l'expérimentation dans le groupe isoflurane sont données dans le tableau 3 . Ces valeurs démontrent que le protocole expérimental possède une cohérence interne et une reproductibilité, car nous avons eu plusieurs techniciens effectuant la chirurgie au cours de deux années. Les nombres et les corrections que nous avons dû effectuer au cours des chirurgies pour maintenir l'hémostase physiologique. _La rétention de CO ₂ , la faible température corporelle et l'hypoglycémie sont certains des facteurs de confusion que nous avons évités grâce à une surveillance et à un ajustement complets si nécessaire.

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Figure 1:. Placement de la ligne périphérique intraveineuse. Un cathéter intraveineux 24 G est placé dans la veine marginale de l'oreille. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Séquence des événements dans l'intubation du porcin. ( A ) Les porcelets sont placés en position reculée latérale pour l'intubation. Des moniteurs standard sont placés. ( B ) Un assistant a déplacé la langue de la cavité buccale alors que le laryngoscopiste effectue une laryngoscopie. ( C ) L'épiglotte est morphologiquement similaire à celle d'un humain. Dans ce graphique, la pointe deE la lame est dans la vallecula. ( D ) L'anatomie du larynx porcin est distinctement différente de celle des humains; Les cordes vocales sont à plusieurs millimètres de profondeur de l'entrée laryngée. Dans ce graphique, la pointe de la lame a déplacé l'épiglotte, exposant le larynx. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Approche de l'artère fémorale. ( A ) La température de l'animal est maintenue à l'aide d'un dispositif de chauffage par air forcé. La surveillance est utilisée tout au long de la procédure. Un vaste champ stérile est préparé avec de la chlorhexidine colorée et l'animal est recouvert d'un drap stérile félisé. ( B ) La palpation au pli inguinal révèle le pouls fémoral. ( C ) A crL'incision aniocaudale de la peau, approximativement perpendiculaire au pli inguinal et d'environ 1,5 cm de longueur, se fait au dessus de la pouls fémorale. ( D ) Une dissolution émoussée est réalisée pour exposer le faisceau neurovasculaire fémoral. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Cannulation de l'artère fémorale. ( A ) De latérale à médiale, le faisceau neurovasculaire contient le nerf fémoral, l'artère et la veine. ( B ) L'artère fémorale est isolée à l'aide de boucles de vaisseau et / ou de suture. Une tension soutenue sur le lien proximal empêche une perte de sang excessive pendant que l'artère est perforée (voir blanchiment du vaisseau). ( C ) Une aiguille est utilisée pour percer le fémoral aRaterie, évitant la perforation de la paroi postérieure de l'artère. Lorsque le sang retourne, un fil de guidage est avancé dans l'artère à travers l'aiguille. ( D ) L'aiguille est retirée et le cathéter est avancé sur le fil de guidage dans le Artère fémorale. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: Comparaison du poids moyen et de l'âge de contrôle et des porcelets traités avec de l'isoflurane. Les barres d'erreur représentent +/- 1 écart type, avec la valeur d'écart type notée au-dessus de chaque barre d'erreur.

Tableau 1: Résumé des signes vitaux du porcelet normal, ArteriAl Blood Gas, et les valeurs d'électrolyte de sérum avec des méthodes de correction suggérées. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce tableau.

Tableau 2: Résumé du poids moyen et de l'âge de contrôle par rapport aux porcelets traités avec de l'isoflurane. Un test T à deux têtes non apparié a été effectué, ne montrant aucune différence significative entre les deux groupes. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce tableau.

Tableau 3: Signes vitaux moyens et valeurs de laboratoire des animaux traités à l'isoflurane. Au cours de laE chirurgies, les écarts des signes vitaux et les valeurs de laboratoire dans les fourchettes normales sont rapidement corrigés. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce tableau.

Discussion

Étapes critiques du protocole / dépannage

Au début de l'expérience, le suivi des signes vitaux non invasifs devrait commencer par l'induction. La pression artérielle, la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène et la température rectale peuvent être facilement obtenues et surveillées. Le porcelet doit être sous un dispositif de réchauffement de l'air pour maintenir une température corporelle adéquate, car ces animaux peuvent devenir hypothermiques rapidement sous anesthésie générale. Le placement rapide d'un cathéter périphérique intraveineux permet de traiter les urgences s'ils surviennent pendant l'induction. Il est important de surveiller en permanence le porcelet, de manière non invasive ou invasive, tant dans la procédure d'isoflurane que dans la procédure de sacrifice. Le porcelet peut subir une désaturation de l'oxygène artériel très rapidement pendant plusieurs étapes tout au long du protocole, en particulier lors de la gestion des voies respiratoires et de l'intubation. Nous utilisons 8% de sévoflurane pour induire une anesthésie afin de reproduire la pratique de la pédiatrie humaine et de faire la publicitéD induction. Cependant, 5% d'isoflurane a été utilisé avec succès et est approprié. Compte tenu des différences d'anatomie et d'une prédisposition au laryngospasme, le porcelet peut être difficile à intuber. Si le porcelet commence à se désaturer lors de la gestion de l'induction et / ou de la voie respiratoire, 100% d'oxygène et de sévoflurane doivent être administrés immédiatement par un cône facial afin de rétablir un niveau de saturation en oxygène et une profonde anesthésie adéquate. Gardez à l'esprit que si le plan d'anesthésie doit être suffisamment profond pour permettre l'intubation, une anesthésie excessive peut entraîner une apnée. Une vigilance continue en ce qui concerne la ventilation et l'oxygénation de l'animal est nécessaire, avec le titrage de l'anesthésie inhalée en conséquence. L'intubation peut ensuite être réessayée une fois que l'oxygénation est rétablie et une anesthésie adéquate a été réalisée. Une ventilation par pression positive par le cône peut être tentée, mais elle est habituellement infructueuse. Si le laryngospasme se produit, l'application de la solution de lidocaïne directement au vocabulaireToutes les cordes sont indiquées pour permettre l'intubation trachéale.

Les médicaments d'urgence devraient toujours être disponibles et devraient être administrés au besoin au cours des parties critiques du protocole pour corriger les perturbations physiologiques. Alors qu'une discussion approfondie sur l'usage de drogues anesthésiques et d'urgence chez les porcelets est hors de portée de ce manuscrit, Swindle's "Swine in the Laboratory: chirurgie, anesthésie, imagerie et techniques expérimentales" est une excellente ressource. ²⁷

De même, le porcelet peut commencer à se désaturer rapidement pendant le sacrifice, après avoir ouvert la cavité thoracique pendant la sternotomie de la ligne médiane. L'opérateur doit fonctionner rapidement mais en toute sécurité pour exposer le cœur et insérer l'angiocatheter pour démarrer le PBS froid. Une perfusion complète de PBS froid (et une fixation rapide avec PFA, si indiqué) est nécessaire pour prévenir les dommages ischémiques au cerveau.

Une fois que le porcelet a été intubé, respiLe rythme rata et le suivi du dioxyde de carbone par la marée finale commencent ( tableau 1 ). Stabilisez l'oxygénation et la ventilation des marées du porcelet en valorisant le support du ventilateur tout en maintenant une anesthésie adéquate. Nous utilisons la ventilation mécanique pour imiter ce qui est utilisé chez les humains aussi près que possible. L'hyperoxie doit être évitée pour minimiser les risques de stress oxydatif.

Les porcelets d'isoflurane subissent une canulation de l'artère fémorale pour 2 raisons: surveiller en permanence la tension artérielle; Et d'échantillonner le sang artériel pour évaluer l'état acide-base, les gaz sanguins et les électrolytes tout au long de la procédure. La canulation de l'artère fémorale peut être difficile. Voir la vidéo pour plus de détails. Pour les expériences de survie, cette procédure doit être effectuée dans un environnement d'exploitation stérile dans des conditions stériles. Après la canulation de l'artère fémorale, commencer la surveillance horaire des gaz sanguins artériels et des électrolytes sériques, en corrigeant le cas échéantMaintenir l'homéostasie ( tableau 1 ). Le porcelet doit recevoir un fluide isotonique contenant du dextrose continu pour maintenir une glycémie adéquate. Tout au long de l'expérience, l'animal doit être surveillé en permanence pour la normalothermie et un réchauffement de l'air forcé devrait être fourni au besoin. Il est tout aussi important d'éviter l'hypothermie et l'hyperthermie.

Alors que ce protocole fournit un hémisphère du cerveau "frais" et un hémisphère de tissu neural fixe, cela peut être facilement adapté pour s'adapter à d'autres modèles d'étude. Des échantillons supplémentaires peuvent également être prélevés sur le porcelet. Le CSF peut être obtenu après anesthésie du porcelet, avec ou sans guidage de la fluoroscopie. Le sang peut également être recueilli à partir du porcelet à différents stades du protocole, y compris le cathéter de l'artère fémorale, ainsi que directement du ventricule gauche via l'angiocatheter immédiatement avant la perfusion. La période de convalescence peut également être allongée ou sh Pour examen de la réponse chronique ou aiguë, respectivement.

Limites de la technique

Ce protocole et ce modèle sont techniquement difficiles. Un enquêteur qualifié et une suite opérationnelle entièrement fournie sont nécessaires, en particulier pour les expériences de survie. L'enquêteur (et l'assistant, pour certaines parties du protocole) doivent être à l'aise avec les composants chirurgicaux et anesthésiques de ce protocole, ce qui peut nécessiter une formation et une expérience à maîtriser. D'autres limitations comprennent le coût des porcelets par rapport aux modèles de rongeurs, bien que le modèle de porcelet soit beaucoup moins coûteux que les primates non humains. Bien que le coût des porcelets varie en fonction de la région et de la ferme à partir de laquelle les animaux sont obtenus, on peut s'attendre à ce que le coût par animal soit inférieur à 500 $, alors que les primates non humains peuvent être des milliers de dollars par animal. Selon notre expérience, le coût moyen par animal est généralement d'environ 200 $.

Jove_content "> Enfin, le but du modèle de porcelet d'imiter le cerveau humain en développement, il faut utiliser uniquement des porcelets néonatals. Le système nerveux central est le plus vulnérable pendant la période de croissance rapide et chez les porcelets, cette période s'étend de Six semaines avant la naissance jusqu'à cinq semaines après la naissance 8. L'utilisation de porcelets plus âgés plus éloignés de leur date de mise à la taille risque d'affaiblir la pertinence clinique du modèle de porcelet. Bien qu'il existe une controverse importante en ce qui concerne l'équivalence du développement du cerveau du porcelet à Celle d'un nouveau-né humain, il existe des similitudes frappantes lorsque le développement précoce du cerveau post-natal entre les humains et les cochons est comparé. Lors de la naissance, les cerveaux des humains et des porcs sont respectivement de 27% et 25% du poids des adultes. ¹⁴ Selon le travail de Johnson Et nos collègues, on peut en déduire qu'une semaine de cochonniers est approximativement équivalente à un mois humain. ⁹ Ces résultats, basés sur wh Ole-Brain volume data, ont été validés par le travail de Workman et ses collègues. ²⁸ Nous avons sélectionné des porcelets de 7-14 jours afin de rapprocher un être humain de 1 à 2 mois. Cependant, il peut être prudent d'utiliser des animaux plus jeunes (1-5 jours) si le but expérimental est d'imiter le zénith de la poussée de croissance du cerveau du porcelet. Ceci est possible, car les porcelets peuvent être sevrés à la naissance. Notre utilisation du modèle de porcelet s'adaptera au fur et à mesure que de nouvelles données seront disponibles en ce qui concerne les parallèles entre le développement du cerveau postnatal chez l'homme et le porc.

Importance de la technique par rapport aux méthodes alternatives / existantes

Le porcelet possède des similitudes frappantes avec les nouveau-nés humains, y compris des parallèles critiques dans le développement du cerveau et des réponses pathophysiologiques. Il s'agit donc d'un modèle de mammifère cliniquement pertinent et l'étude de la preuve de concept indique que le porcelet est un modèle approprié pour l'étude de la neurotoxicité anesthésiante"29 ^{, 30.} Il peut également être facilement adapté à d'autres types de recherche en neuroscience du développement. Le modèle est conçu pour étudier, avec l'autorité scientifique, l'étendue et le mécanisme de l'AIDN minimisant les préoccupations que les facteurs de confusion, tels que l'hypoxie ou l'hypercarbie, sont Causant un dommage neurologique qui pourrait être mal interprété comme induit par anesthésie. Pour ce faire, le porcelet est traité avec les mêmes conditions périopératoires chirurgicales et anesthésiques et le suivi des patients pédiatriques.

Orientations et applications futures après maîtriser la technique

En avant, les porcelets sont également très favorables aux tests neurocognitifs ¹⁷ . Cet attribut permettra une évaluation complète et complète des résultats neurocognitifs après exposition anesthésique dans les expériences futures. Il convient également de souligner que, dans le contexte clinique, les enfants subissent le plus souvent une anesthésie pourUne procédure physiologiquement stressante (chirurgie). Les interactions entre l'anesthésie et l'inflammation post-chirurgicale ainsi que la lésion neuronale résultante et / ou la toxicité (comme on le voit chez les rongeurs et les primates) méritent une exploration et une considération importantes. Le porcelet néonatal fournit un modèle de référence unique et cliniquement pertinent pour les effets des anesthésiques sur le cerveau en développement sans l'influence confuse de la chirurgie (imitant les scénarios cliniques courants chez les enfants). L'impact de différents types de chirurgie ou d'autres facteurs de confusion (ischémie, lésions cérébrales, prédisposition génétique, etc. ) peut maintenant être testé avec fiabilité à l'aide de ce modèle.

En laboratoire, nous prévoyons utiliser de multiples méthodes électrophysiologiques et électrochimiques pour approfondir les mécanismes d'anesthésie et d'AIDN dans des circuits neuronaux intacts. Ces techniques comprennent la mesure in vivo de l'activité des neurotransmetteurs, des enregistrements de patch-clamp à cellules entières, des neuroimagerie etEnquêtes neurophysiologiques dans des tranches de cerveau. En ce qui concerne les neurosciences dans le cerveau immature, les porcelets sont plus pertinents pour les humains que les modèles murins avec très peu d'inconvénients présents avec les primates non humains. Avec un développement ultérieur, les porcelets peuvent être le modèle idéal pour la recherche sur les neurosciences du développement humain.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liqui-Wean	Milk Specialities	454836
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask	VetEquip	921428
Masterflex L/S Peristaltic Pump	Cole-Parmer	EW-77916-20	Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved
Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft	Cole-Parmer	EW-96410-24
14 G angiocatheter	Becton-Dickson	381164
10x PBS	Thermo-Fisher Scientific
Paraformaldehyde powder	Sigma-Aldrich	P6148-5KG	Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased.
2-methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631-4L
Needle holder	Teleflex	152720
Right angle clamp	Teleflex	496217
Rongeurs	Teleflex	028120
Tenotomy scissors	Teleflex	423480
Stitch scissors	Teleflex	423440
McPherson Tying Forceps	Teleflex	425200
Adson Tissue Forceps	Teleflex	181223
3-0 nylon suture	Medline	ETH627H
Integra SL Anesthesia Workstation	DRE Veterinary	2350	This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.
Laryngoscope handle	Teleflex	8710000
Miller 1 Laryngoscope blade	Teleflex	2216100
Bair Hugger	3M	750
Bair Hugger Torso Blanket	3M	540
iStat Handheld	Abbott Point of Care	300	Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used
iStat Cartridges	Abbott Point of Care	CG8+
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive	Ethicon	DNX6
LMA Laryngotracheal Atomization Device	Teleflex	MAD720	A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube	Teleflex	5-10106	This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment
Pediatric Intubation Stylet	Smiths Medical	100/120/100
24 G angiocatheter	Becton-Dickson	381112
#10 Disposable Scalpel	Ted Pella, Inc	549-9-10
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter)	Cook Medical	C-PMSY-300-FA	Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used
Intramedic PE90 Polyethylene tubing	Fisher Scientific	14-170-12D
Monoject Blunt Cannula	VWR International	15141-144