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摘要

我们表明用于体内实时生物发光和近红外中在SJL / J小鼠多发性硬化的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型视神经炎和脑炎的成像技术。

摘要

在SJL / J小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是复发缓解型多发性硬化症（RRMS）的模型。描述运动功能障碍的临床EAE分数是脊髓的免疫介导的炎症的基本读数。但是，得分和体重不允许大脑炎症和视神经炎的体内评估。后者是在MS患者的大约2/3的早期和频繁表现。这里，我们表明使用体内成像系统在活小鼠生物发光和近红外实时成像以评估EAE诱发视神经炎，脑炎症，和血-脑屏障（BBB）的破坏的方法。通过氧化酶激活的生物发光底物，主要表现为视神经炎。该信号是具体和允许的药物治疗效果和疾病时程可视化，从而平行临床得分。聚乙二醇化荧光纳米粒子仍然是vasculatur内e表示延长的时间段被用来评估血脑屏障完整性。近红外成像显示在疾病的峰的血脑屏障渗漏。该信号是眼睛周围的最强的。为基质金属蛋白酶近红外基材是用来评估EAE诱发炎症。自动荧光干扰信号，要求对定量光谱分离。总体而言，生物发光成像是评估EAE相关视神经炎和药物作用的可靠的方法，并在信号的特异性，鲁棒性，易于量化的，和成本方面优于近红外技术。

引言

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord1. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors4 but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans5. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments6, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods7, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)8, and cathepsins9 or cyclooxygenase2. These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE11. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration12, suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination13. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination14. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers5.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin5, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

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研究方案

1. EAE诱导SJL / J小鼠

  1. 老鼠
    1. 使用11周龄的雌性SJL / J小鼠，并允许他们使其习惯的实验室进行约7天。使用每组N = 10只。
    2. 对于药物影响的评估，通过饮用水或通过启动免疫后3或5天（每组n = 10）的食物颗粒连续地管理为对照组的药物和安慰剂。在疾病的高峰期，管理药物或安慰剂用牛奶或3％的糖水渍玉米片。
  2. 免疫物质
    1. 在用完全弗氏佐剂（CFA，热杀死的结核分枝杆菌H37 Ra）和2小瓶（5微克每）的乳液使用EAE诱导试剂盒由抗原（蛋白脂质蛋白的肽，PLP139-151，1毫克/毫升的乳剂）冻干百日咳毒素（PTX）。
    2. 溶解PTX（2微克/毫升）在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS; 即</ em>的加1.5毫升的PBS每个PTX管，拌匀，用相同的枪头删除，并添加1毫升的PBS在50毫升管）;拌匀。
  3. 免疫接种
    1. 注入PLP / CFA皮下注射2份，每份100微升，同时在尾的基部。不注入颈后，因为在上背部或颈部的皮肤的任何免疫反应将干扰头部和脊髓的成像。
    2. 注入100μL的PTX腹膜内（IP）的，每只小鼠两次，第1 - 免疫后2小时，第二个为24小时。
    3. 对于对照小鼠，注射CFA而不PLP（100μL2份）加紫杉醇而不PLP。
  4. 免疫接种后的鼠标处理
    1. 称量小鼠隔日达7天，然后每天的体重它们。
      注:老鼠损失大约1 - EAE在进行二克的机身重量。下降标志着EAE的发作。
    2. 从第7天，每天符合评估的临床症状ING的标准评分系统（即 0分:在运动功能无明显变化;得分0.5:尾部的远端瘫痪;比分1:完整的尾巴瘫痪;得分1.5:一个或两个后肢轻度麻痹; 2分:后腿严重麻痹;得分2.5:一只后腿完全瘫痪; 3分:两条后腿完全瘫痪;得分3.5:后腿和一个前腿麻痹完全瘫痪安乐死小鼠的3.5或更高的分数> 12小时。
  5. 当然EAE和成像的时间
    1. 在该疾病的发病执行第一成像，当小鼠达到分数> 1，这将发生约10天 - 免疫后12。
    2. 3天 - 在高峰期，这将达到1或2天的初期症状发展后，将持续1执行第二成像。
      注意:此后，小鼠将充分于7至10天恢复。间隔在成像过程中可能仍然显示血管泄漏，但炎症的指标应该是否定的。

2.生物发光和视神经炎及脑部炎症的近红外成像

  1. 成像系统的设置
    1. 执行的体内成像的任何设备，允许生物发光和近红外信号的分析。
    2. 不时2鼠标 - 2.5％，异氟醚麻醉过程中的所有成像过程。
    3. 位置的一个或使用中间的天然气供应在装置彼此旁边两只老鼠。在中心的脊柱上部位置。
    4. 同时使用两只老鼠，每一组都有，对于药物影响的评价比较对。这对于生物发光成像重要。
    5. 盾用黑布免疫的网站，并拍摄照片和基准图像来评估鼠标/小鼠的正确定位。使用B对焦一个6.5厘米的距离相机的所有图像。
  2. 注射液和生物发光炎症探头成像
    1. 使用活体成像系统设置:外延BLI，EM过滤开，防爆过滤块，fstop 1，分档8，关注B =6.5厘米，广告曝光120秒;取基准图像。
    2. 注入准备使用的化学发光试剂（40毫克/毫升）的100微升的ip。灌装注射器之前拌匀。
    3. 捕捉生物发光图像5，10和注射后15分钟。生物发光峰值的时间过程的动物之间是不同的。
      注:峰值将出现5 - 注射后10分钟;在15分钟的下降表明不需要进一步的图像。使用控制和治疗组小鼠对消除偏见未成年人由于不同的时间进程。
    4. 填写相关的实验说明。观察一个对话框会自动弹出;它包括信息，如小鼠品系，性别，时间点，探针注射，组等的时间。保存文件中的所有邻NE文件夹;他们将有时间标签和所有描述。
  3. 注入和成像BBB完整性近红外荧光纳米粒子
    1. 在B-焦（6.5公分距离）使用近红外成像落射荧光。聚乙二醇化的荧光纳米粒子的激发/发射最大值是690分之675纳米。捕获在不同的波长，在Ex640 / Em700和Ex675 / EM720两个图像;使用2-S曝光，分箱8和fstop 2.取一个基准图像。
    2. 注入四70μL的聚乙二醇化的荧光红外线纳米颗粒的通过尾静脉和想象小鼠3小时，使用上述设置注射后24小时。灌装注射器之前搅拌溶解良好。
    3. 在对照小鼠，这将需要进行评估的信号的特异性注入0.9％氯化钠。
  4. 注射和MMP活性的近红外荧光探针的成像
    1. 剃须或脱毛头部和uPPER脊区采取基线映像之前谨慎一天。皮肤不能受伤。
    2. 在B-焦（6.5公分距离）使用近红外成像落射荧光。基质金属蛋白酶活化探针的激发/发射最大值是700分之680纳米。捕获在不同的波长，在Ex640 / Em700和Ex675 / EM720两个图像;使用1-S曝光，分箱8和fstop 2.取一个基准图像。
    3. 添加200μL的1×PBS中的至准备使用的解决方案（20纳摩尔/ 1.5毫升在1×PBS中），因此，这将是足够的10只小鼠的1.5毫升管;灌装注射器之前拌匀。
      注意:提供体积不考虑某些容积注射器填充和注射过程中丢失的帐户。
    4. 成像前注入探针四的150微升通过尾静脉24小时。只在对照动物注射的PBS，以评估信号的特异性。
    5. 在注射后24小时，采取落射荧光图像至少在两个波长Ex640 / Em700和Ex 675 / EM720，与设置上述（1 - S的曝光，对焦B，分箱8，和fstop 2）进行说明。
      注:使用两种波长的允许光谱分离减去非特异性信号。

3.图像分析

  1. 生物发光分析（BLI）
    1. 双击软件来打开它。
    2. 在菜单栏上，点击文件浏览器图标，进入实验的文件夹目录，然后选择它;这将在表中的文件夹中打开的所有文件。
    3. 配置示出有关的实验的描述的列。
    4. 对于质量控制，对非应答鼠标文件而不EAE和/或天真鼠标症状双击检查EAE信号的特异性。
      注:应该有天真的小鼠和非应答小鼠最小的信号没有信号。
      1. 亲注射前检查基线图像对于每个小鼠作为信号的特异性的进一步控制;它应该是负的。
    5. 要选择一个图像，就先EAE小鼠的第一个文件，然后双击并检查力度生物发光（LUT条范围）和本地化。检查所有图像逐一。关闭与每个鼠标的最低强度的文件（ 即 ，保持2出3图像的每个鼠标）。
    6. 图像调整和出口
      1. 双击进行量化的第一个文件。观察一个新的窗口弹出。在"选项"（上一级菜单），自定义标签每个图像中显示。
      2. 在右边的工具选项板，进入"图像调整"。缺省情况下，最小和最大强度被设置为"自动"和彩虹伪显示。选择"手动"，如果需要更改设置。
        注:例如，所有导出的图像可能有相同的LUT条（相同的最小值和最大值）是易于比较。的最小值和最大值的调整对定量结果没有任何影响。
      3. 点击图片导出，选择PNG，目录，图像名
    7. 感兴趣区域的定量分析（ROI）
      1. 转到工具选项板中的"投资回报率"的工具。选择的ROI方法（圆圈，矩形，汽车，或自由手）和感兴趣区域的数目。观察ROI窗口在图像窗口弹出。
      2. 使用鼠标，调整大小和位置。如果使用自动ROI工具中使用相同的ROI阈值的所有图像。如果投资回报率大小和位置手动（ 例如，圆形的投资回报）定义使用相同的领域的所有图像。
      3. 点击"衡量RO.I.观察一个新的窗口弹出，自定义的列（如文件名，动物数量，组，实验区，总计数，平均计数，计数SD，最大和最小数，面积，时间点，注射探针等 ）的时间。保存自定义设置。当再安以轩，选择所有（按Ctrl + A），复制并表粘贴到电子表格。
      4. 导出图像作为替代的投资回报为PNG。保存并关闭图像文件。
    8. 重复该过程（步骤3.1.6 - 3.1.7）对需要进行量化的所有图像文件。所有的投资回报率quantifications复制到电子表格。
      注:在这里，结果可以通过组，时间点等进行分类和统计分析。使用生物发光信号的总数在感兴趣区为统计分析。
  2. 荧光纳米粒子的近红外（NIR）分析
    1. 在软件使用控制，调整图像的阈值。
      注意:这对定量结果没有影响。
    2. 目视比较在实施例/ EM七百二十零分之六百七十五和Ex / Em比值七百分之六百四十零捕获，以评估信号的特异性的图像。
    3. 在使用前/ EM七百二十零分之六百七十五拍摄的图像进行定量分析（激发最大:680纳米）。定义的ROI，可以使用的量，自动ROI工具。调整自动ROI阈值和使用它的所有图像。量化的投资回报的总辐射效率（见步骤3.1）。
  3. 蛋白酶敏感探针的近红外（NIR）分析
    1. 利用软件控制，调整图像的门槛。
      注意:这对定量结果没有影响。执行自动荧光光谱分离。去混合工具在生活图像来实现。自去混合使用防爆/ EM七百分之六百四十零作为具体七百二十零分之六百七十五作为自体荧光图像。
    2. 选择未混合图像和定义的ROI，如上所述。使用投资回报的总辐射效率的量化和统计分析。

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结果

视神经炎的生物发光的时间进程

炎症探针的生物发光信号是眼睛周围的最强和只在EAE小鼠视神经炎的发生。发生在没有非EAE小鼠也不不与炎症探针注入的小鼠的信号。当小白鼠恢复的信号消失了。因此，该信号是特异于视神经炎，信号的峰值平行于临床EAE分数的峰。 图1示出了在EAE诱导后第10天14成像...

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讨论

本视频显示了在 SJL / J小鼠EAE的体内成像生物发光和近红外荧光的技术。我们表明，使用炎症敏感探针生物发光成像主要表示视神经炎，以及量化与EAE严重程度的临床评估和药物的效果一致。但是，由于该信号被脊柱所吸收的生物发光成像方法是不能检测的腰脊髓，这是EAE表现17的原发部位的炎症，可能的。

近红外成像是更敏感，但在与自体荧?...

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披露声明

作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

致谢

这项研究是由德意志研究联合会（CRC1039 A3）和研究资助计划黑森州，研究中心转化医学和药理学TMP的国家"Landesoffensive祖尔发展协会wissenschaftlich-ökonomischerExzellenz"（LOEWE）和否则克朗，费森尤斯基金会支持（EKFS），研究培训组转化研究创新 - 制药（TRIP）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AngioSpark-680Perkin Elmer, Inc., Waltham, USANEV10149Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680Perkin Elmer, Inc., Waltham, USANEV10126Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation ProbePerkin Elmer, Inc., Waltham, USA760535Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion Hooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123EAE induction kit
Pertussis ToxinHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123EAE induction kit
IVIS Lumina SpectrumPerkin Elmer, Inc., Waltham, USABioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software Perkin Elmer, Inc., Waltham, USACLS136334IVIS analysis software
IsofluraneAbbott Labs, Illinois, USA26675-46-7Anaesthetic

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