Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Zusammenfassung

Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.

Zusammenfassung

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) in SJL / J-Mäusen ist ein Modell für rezidivierend-remittierender Multipler Sklerose (RRMS). Klinische EAE Scores Motorik Defizite beschreiben, sind Grund Auslesungen der immunvermittelte Entzündung des Rückenmarks. Allerdings Gewicht Scores und Körper nicht erlauben , für eine in vivo Beurteilung der Entzündung des Gehirns und Neuritis. Letzteres ist eine frühe und häufige Erscheinung in etwa 2/3 MS-Patienten. Hier zeigen wir Methoden für die Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Live - Bildgebung zur Beurteilung EAE Neuritis hervorgerufen, Gehirnentzündung und Blut-Hirn - Schranke (BHS) Störung in lebenden Mäusen unter Verwendung eines in vivo - Bildgebungssystem. Ein Biolumineszenz-Substrat aktiviert durch Oxidasen zeigte in erster Linie optische Neuritis. Das Signal war spezifisch und erlaubt die Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und Krankheitszeitkurse, die die klinischen Bewertungen einher. Pegyliertem fluoreszierende Nanopartikel, die innerhalb der vasculatur bliebe für längere Zeiträume verwendet wurden, die BBB Integrität zu beurteilen. Nah-Infrarot-Bildgebung ergab einen BBB-Leck auf dem Höhepunkt der Krankheit. Das Signal war das stärkste um die Augen. Ein Nahinfrarot-Substrat für Matrixmetalloproteinasen wurde verwendet EAE-evozierte Entzündung zu beurteilen. Auto-Fluoreszenz mischte sich mit dem Signal, erfordern Entmischung zur Quantifizierung. Insgesamt war Biolumineszenz-Bildgebung eine zuverlässige Methode EAE-assoziierte optische Neuritis und Medikamente Effekte und war besser als die Nah-Infrarot-Techniken in Bezug auf Signal Spezifität, Robustheit, einfache Quantifizierung und Kosten zu bewerten.

Einleitung

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord¹. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries^2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors⁴ but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans⁵. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments⁶, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods⁷, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)⁸, and cathepsins⁹ or cyclooxygenase². These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis^9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE¹¹. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration¹², suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination¹³. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination¹⁴. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers⁵.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination^15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin⁵, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

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Protokoll

1. EAE Induktion in SJL / J-Mäuse

1. Mäuse
   1. Verwenden Sie 11-Wochen alte weibliche SJL / J-Mäuse und es ihnen ermöglichen, für ca. 7 Tage zur experimentellen Raum zu gewöhnen. Verwenden Sie n = 10 Mäuse pro Gruppe.
   2. Für die Beurteilung der Arzneimittelwirkungen, die Verwaltung der Drogen-und Placebo für die Kontrollgruppe kontinuierlich über das Trinkwasser oder über Futterpellets beginnend 3 oder 5 Tage nach der Immunisierung (n = 10 pro Gruppe). Während der Höhepunkt der Krankheit, Medikamente verabreichen oder Placebo mit Milch oder 3% Zucker mit Wasser getränkten Maisflocken.
2. Immunization Material
   1. Verwenden ein EAE Induktions Kit, bestehend aus Antigen (Peptid von Proteolipidprotein, PLP 139-151, 1 mg / ml Emulsion) in einer Emulsion mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA, Hitze abgetötete Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) und 2 Ampullen (jeweils 5 ug) lyophilisierter Pertussistoxin (PTX).
   2. Man löst den PTX (2 ug / ml) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; dh </ Em> 1,5 ml PBS in jedes PTX Rohr, fügen Sie gut mischen, entfernen Sie mit der gleichen Pipettenspitze, und zu 1 ml PBS in einem 50-ml-Röhrchen hinzufügen); gut mischen.
3. Immunisierung
   1. Injizieren PLP / CFA subkutan in 2 Portionen, die jeweils 100 & mgr; l, die beide an der Basis des Schwanzes. Nicht in die Rückseite des Halses zu injizieren, da alle Immunreaktionen in der Haut im oberen Rücken oder Nacken-Bildgebung des Kopfes und des Rückenmarks stören.
   2. Injizieren von 100 & mgr; l PTX intraperitoneal (ip) zweimal pro Maus, wobei der erste 1 bis 2 h nach der Immunisierung und die zweite bei 24 h.
   3. Für die Kontrollmäuse, injizieren CFA ohne PLP (2 Portionen von 100 & mgr; l) und PTX ohne PLP.
4. Maus - Handling nach der Immunisierung
   1. Wiegen Sie die Mäuse jeden zweiten Tag bis zum Tag 7, und sie dann täglich wiegen.
      HINWEIS: Die Mäuse verlieren etwa 1 bis 2 g Körpergewicht während der EAE. Der Rückgang markiert den Beginn der EAE.
   2. Beurteilen der klinischen Symptome täglich von Tag 7 according zu den Standard - Scoring - Systeme (dh Ergebnis 0: keine offensichtlichen Veränderungen in der Motorik; Score 0,5: distale Lähmung des Schwanzes; erzielt 1: komplette Schwanz Lähmung; Note 1.5: leichte Parese eines oder beider Hinterbeine; Stand 2: schwere Parese der Hinterbeine; Note 2.5: vollständige Lähmung eines Hinterbein; Stand 3: vollständige Lähmung beider Hinterbeine; 3.5 punkten. völlige Lähmung der Hinterbeine und Lähmung eines Vorderbein Euthanize Mäuse mit Noten von 3,5 oder höher für > 12 h.
5. EAE Kurs und Zeit der Bildgebung
   1. Führen Sie die erste Abbildungs ​​beim Einsetzen der Krankheit, wenn die Mäuse Scores erreichen> 1, die etwa 10 Tage auftreten - 12 nach der Immunisierung.
   2. Führen Sie die zweite Bildgebung an der Spitze, die 1 oder 2 Tagen erreicht wird, nachdem die ersten Symptome entwickeln und wird für 1 dauern - 3 Tage.
      HINWEIS: Anschließend wird die Mäuse vollständig innerhalb von 7 bis 10 Tagen genesen. Imaging während der Intervalle können noch vaskuläre Undichtigkeiten aufweisen,aber Entzündung Indikatoren negativ sein sollte.

2. Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung

1. Setup des Abbildungssystems
   1. Führen in vivo - Bildgebung mit der Ausrüstung, die für die Analyse der Biolumineszenz und nahen infraroten Signalen ermöglicht.
   2. Halten Mäuse unter 2-2,5% Isofluran-Narkose bei allen bildgebenden Verfahren.
   3. Position eins oder zwei Mäuse nebeneinander in der Vorrichtung die mittleren Gasversorgung verwendet wird. Positionieren Sie den oberen Wirbelsäule in der Mitte.
   4. Verwenden Sie zwei Mäuse gleichzeitig, eine pro Gruppe, für die Bewertung von Medikamenten Effekte Paare zu vergleichen. Dies ist wichtig für Biolumineszenz-Bildgebung.
   5. Abschirmen Stelle der Immunisierung mit schwarzem Tuch und nehmen ein Foto und Ausgangsbild die richtige Positionierung der Maus / Mäuse zu bewerten. Verwenden, um die B-Fokus mit einem 6,5-cm Abstand zur Kamera für alle Bilder.
2. Injektion und Bildgebung von Biolumineszenz Entzündung Sonde
   1. Verwenden Sie die in - vivo - Bildgebung Systemeinstellungen: Epi-BLI, Em Filter geöffnet, Ex - Filterblock, fstop 1, Binning 8, konzentrieren sich B = 6,5 cm, Anzeigenpräsenz 120 s; nehmen ein Grundbild.
   2. Inject 100 ul ip der ready-to-use Chemilumineszenzmittellösung (40 mg / ml). Gut mischen, bevor die Spritze zu füllen.
   3. Erfassen Biolumineszenz Bilder 5, 10 und 15 min nach der Injektion. Der Zeitverlauf der biolumineszenten peak unterscheidet zwischen Tieren.
      HINWEIS: Die Spitze 5 auftreten - 10 Minuten nach der Injektion; ein Rückgang bei 15 min zeigt an, dass keine weiteren Bilder erforderlich sind. Mit der Maus Paare von Kontroll- und Behandlungsgruppen geringfügige Verzerrungen zu beseitigen, wegen der unterschiedlichen Zeitkurse.
   4. Füllen Sie Beschreibungen relevant für das Experiment. Beachten Sie ein Dialogfenster öffnet sich automatisch; es enthält Informationen, wie zum Beispiel Maus - Stamm, Geschlecht, Zeitpunkt, Zeitpunkt der Sonde Injektion, Gruppe usw. Speichern Sie die Dateien alle in one-Ordner; sie werden Zeit-Tags und alle Beschreibungen haben.
3. Injektion und Bildgebung von Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Nanopartikel für BBB - Integrität
   1. Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der pegylierten fluoreszierende Nanopartikel sind 675/690 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 2-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen.
   2. Injizieren 70 & mgr; l von pegyliertem fluoreszierenden Infrarot-Nanopartikel iv durch die Schwanzvene und stellen Sie sich die Mäuse 3 h und 24 h nach der Injektion die obigen Einstellungen. Mischen Sie die Lösung gut, bevor die Spritze zu füllen.
   3. Injizieren 0,9% Natriumchlorid in Kontrollmäusen, die benötigt wird, um die Spezifität des Signals zu bewerten.
4. Injektion und Abbildung des nahen Infrarot fluoreszierende Sonde für MMP - Aktivität
   1. Shave oder enthaaren den Kopf und upper Rückenbereich vorsichtig einen Tag vor dem Ausgangsbild nehmen. Die Haut darf nicht verletzt werden.
   2. Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der MMP aktivierbare Sonde sind 680/700 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 1-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen.
   3. Mit 200 & mgr; l 1x PBS auf das 1,5-ml-Röhrchen der ready-to-use-Lösung (20 nmol / 1,5 ml in 1x PBS), so dass es für 10 Mäuse ausreichend sein wird; gut mischen, bevor die Spritze zu füllen.
      HINWEIS: Die bereitgestellten Volumen nimmt nicht berücksichtigt, dass einige Volumen während Spritzenfüllanlage und Injektion verloren.
   4. Inject 150 ul der Sonde iv durch die Schwanzvene 24 h vor der Bildgebung. Injizieren PBS nur in Kontrolltieren die Spezifität des Signals zu bewerten.
   5. Bei 24 Stunden nach der Injektion, nehmen Epi-FL Bilder zumindest bei zwei Wellenlängen, Ex640 / Em700 und Ex 675 / EM720, mit den Einstellungen oben erläutert (1-s Belichtung, Fokus B, Binning 8 und fstop 2).
      HINWEIS: Die Verwendung von zwei Wellenlängen ermöglicht Entmischung durch die unspezifische Signal subtrahiert wird.

3. Bildanalysen

1. Biolumineszenz - Analyse (BLI)
   1. Doppelklicken Sie auf die Software, um es zu öffnen.
   2. In der oberen Menüleiste, klicken Sie auf den Datei - Browser - Symbol, gehen Sie in das Verzeichnis des Ordners des Experiments, und wählen Sie sie aus ; Dadurch werden alle Dateien im Ordner in einer Tabelle öffnen.
   3. Konfigurieren Sie die Spalten die Beschreibungen relevant für das Experiment zeigt.
   4. Für die Qualitätskontrolle, doppelklicken Sie auf eine Datei von einem Non-Responder-Maus ohne Symptome von EAE und / oder einem naiven Maus, um die Spezifität der EAE-Signale zu überprüfen.
      HINWEIS: Es sollte in Non-Responder-Mäuse kein Signal in naiven Mäusen und minimale Signal sein.
      1. Überprüfen Sie die Basislinienbild vor dem Einspritzen des Prowerden für jede Maus als weitere Kontrolle der Spezifität des Signals; es sollte negativ sein.
   5. Um ein Bild zu wählen, doppelklicken Sie auf die erste Datei des ersten EAE Maus und überprüfen Sie die Biolumineszenz-Intensität (LUT Bar-Bereich) und Lokalisierung. Überprüfen Sie alle Bilder nacheinander. Schließen Sie die Datei mit der niedrigsten Intensität für jede Maus (dh halten 2 von 3 Bildern pro Maus).
   6. Bildeinstellung und Ausfuhr
      1. Doppelklicken Sie auf die erste Datei zu quantifizieren. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Unter "Optionen" (oberes Menü), passen Sie die Etiketten in jedem Bild angezeigt werden soll.
      2. In der rechten Werkzeugpalette, gehen Sie zu "Bildeinstellung." Standardmäßig werden die minimalen und maximalen Intensitäten auf "auto" und in den Regenbogenpseudo angezeigt. Wählen Sie "Manuell", um die Einstellungen zu ändern, falls erforderlich.
         HINWEIS: Zum Beispiel werden alle exportierten Bilder können gleich LUT Bars haben (identische Minima und Maxima) zu sein, leicht vergleichbar.Die Einstellung der Minima und Maxima hat keine Auswirkungen auf die quantitativen Ergebnisse.
      3. Klicken Sie auf das Bild zu exportieren, wählen png, das Verzeichnis, und ein Bild, Namen
   7. Die Quantifizierung der Regions of Interest (ROI)
      1. Gehen Sie auf die "ROI" Werkzeug in der Werkzeugpalette. Wählen Sie den ROI-Methode (Kreis, Rechteck, Auto, oder frei Hand) und die Anzahl der ROIs. Beachten Sie die ROI-Fenster im Bildfenster Pop.
      2. Mit der Maus, passen Sie die Größe und Position. Verwenden Sie identische ROI Schwellenwerte für alle Bilder, wenn die Auto-ROI-Tool verwendet wird. Verwenden Sie identische Bereiche für alle Bilder , wenn ROI Größen und Positionen manuell definiert werden (zB Kreis ROIs).
      3. Klicken Sie auf "messen RO.I. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Passen Sie die Spalten (zB Dateiname, Tiernummer, Gruppe, Experiment, Fläche, insgesamt zählt, Durchschnitt zählt, SD zählt, min und max zählt, Fläche, Zeit Punkt, der Zeit der Sonde Injektion, etc.). speichern Sie die benutzerdefinierten Einstellungen. Wenn ReAdy, alle auswählen (Strg + A) und kopieren und die Tabelle in eine Tabelle einfügen.
      4. Exportieren Sie das Bild als png mit den ROIs an Ort und Stelle. Speichern und schließen Sie die Bilddatei.
   8. Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 3.1.6 - 3.1.7) für alle Bilddateien, die quantifiziert werden müssen. Kopieren Sie alle ROI Quantifizierungen in die Tabelle.
      HINWEIS: Hier können die Ergebnisse nach Gruppen, Zeitpunkt sortiert, usw. und statistisch ausgewertet. Verwenden Sie die Gesamtzahl der Biolumineszenz-Signale in der ROIs für statistische Auswertungen.
2. Nah-Infrarot (NIR) Analyse von fluoreszierenden Nanopartikeln
   1. Verwenden der Bedienelemente in der Software, stellen Sie die Schwelle des Bildes.
      ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis.
   2. Optisch vergleichen die bei Ex / Em aufgenommenen Bilder 675/720 und Ex / Em 640/700 die Spezifität des Signals zu bewerten.
   3. Verwenden Sie die aufgenommenen Bilder bei Ex / Em 675/720 für die quantitative Analyse (Anregungsmaximum: 680 nm). Definieren ROIs, für die die automatische ROI Werkzeug verwendet werden kann. Stellen Sie die Auto-ROI Schwelle und verwenden Sie es für alle Bilder. Quantifizieren der Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs (siehe Schritt 3.1).
3. Nah-Infrarot (NIR) Analyse von Protease-empfindliche Sonde
   1. Der Einsatz von Software steuert, stellen Sie die Schwelle des Bildes.
      ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. Führen Entmischung der Autofluoreszenz. Die Entmischung Werkzeug in lebenden Bild umgesetzt. Die Auto-Entmischung verwendet die Ex / Em 640/700 als spezifische und 675/720 als Autofluoreszenzbild.
   2. Wählen Sie das ungemischte Bild und definieren Sie die ROIs, wie oben beschrieben. Verwenden Sie die Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs für quantitative und statistische Analysen.

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Ergebnisse

Zeitverlauf der Biolumineszenz von Neuritis

Das Biolumineszenz-Signal der Entzündung Sonde war das stärkste um die Augen und trat ausschließlich in EAE Mäuse mit Optikusneuritis. Ein Signal, trat bei keiner der nicht-EAE Mäuse noch die Mäuse nicht mit der Entzündung Sonde injiziert. Das Signal verschwunden, wenn die Mäuse gewonnen. Daher ist das Signal für Optikusneuritis spezifisch und die Spitze des...

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Diskussion

Die vorliegende Video zeigt Techniken zur Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Fluoreszenz in vivo Bildgebung von EAE in SJL / J - Mäusen. Wir zeigen, dass Biolumineszenz-Bildgebung eine entzündungs ​​empfindliche Sonde zeigt hauptsächlich optische Neuritis verwenden, und die Quantifizierung stimmt mit der klinischen Bewertung von EAE Schwere und die Auswirkungen von Medikamenten. Jedoch war die Biolumineszenz - Bildgebungsverfahren nicht in der Lage Entzündung des lumbalen Rückenmarks zu erkennen, die ei...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
Pertussis Toxin	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS analysis software
Isoflurane	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	Anaesthetic