マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

要約

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。

要約

SJL / Jマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、再発寛解型多発性硬化症（RRMS）のモデルです。運動機能障害を記述する臨床EAEスコアは、脊髄の免疫媒介炎症の基本的な読み出しです。しかし、スコアおよび体重は脳の炎症と視神経炎のin vivoで評価することができません。後者は、約2/3のMS患者の早期かつ頻繁な症状です。ここでは、 インビボイメージングシステムを用いて、生きているマウスにおける生物発光およびEAEの視神経炎を誘発評価するための近赤外ライブイメージング、脳の炎症、及び血液脳関門（BBB）破壊するための方法を示します。酸化酵素によって活性化された生物発光基質は、主に視神経炎を示しました。信号は特異的であり、臨床スコアを並列薬の効果や病気の時間のコース、の可視化を可能にしました。 vasculatur内に留まったペグ化蛍光ナノ粒子長時間eがBBBの完全性を評価するために使用しました。近赤外イメージングは​​、疾患のピーク時BBB漏れを明らかにしました。信号は、目の周りの最も強かったです。マトリックスメタロプロテアーゼのための近赤外基質は、EAE誘発炎症を評価しました。自家蛍光は、定量化のためのスペクトルアンミキシングを必要とし、信号を妨害しました。全体として、生物発光イメージングは​​、EAEに関連する視神経炎および薬物の効果を評価するための信頼性の高い方法であり、シグナルの特異性、堅牢性、定量化の容易さ、及びコストの観点から近赤外の技術よりも優れていました。

概要

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord¹. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries^2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors⁴ but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans⁵. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments⁶, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods⁷, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)⁸, and cathepsins⁹ or cyclooxygenase². These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis^9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE¹¹. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration¹², suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination¹³. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination¹⁴. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers⁵.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination^15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin⁵, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

プロトコル

SJL / Jマウスにおける1 EAEの誘導

1. マウス
   1. 11週齢の雌SJL / Jマウスを使用し、それらは約7日間の実験室に馴化することができます。グループあたりのn = 10匹のマウスを使用してください。
   2. 薬物の効果を評価するために、免疫後3又は5日出発連続飲料水を介してまたは餌ペレットを介して制御グループの薬物およびプラセボを投与する（群あたりn = 10）。疾患のピーク時には、牛乳または3％の砂糖水に浸したコーンフレークと薬またはプラセボを投与します。
2. 予防接種材料
   1. 完全フロイントアジュバント（CFA、熱殺菌された結核菌H37 Ra）が2バイアル（各5μg）とエマルジョン中の抗原からなるEAE誘導キット（プロテオリピドタンパク質のペプチド、PLP139-151、1mg / mlのエマルジョン）を使用します凍結乾燥した百日咳毒素（PTX）の。
   2. すなわち、<; 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBSにPTX（2μg/ ml）を溶解させ/ em>の）、各PTXチューブにPBSの1.5 mLを加え、よく混ぜ、同じピペットチップで除去し、50 mLチューブ中の1mLのPBSに追加します。よく混ぜます。
3. 免疫
   1. 尾の基部に、2箇所にそれぞれ100μL、両方をPLP / CFAの皮下に注入します。背中上部または首の皮膚内の任意の免疫反応が頭のイメージングおよび脊髄の障害になるので、首の後ろに注入しないでください。
   2. 免疫後2時間および24時間で二 - 、二回マウス当たり、腹腔内（ip）第1のPTXの100μLを注入します。
   3. 対照マウスでは、PLPなしPLPなしCFA（100μLの2箇所）を加えたPTXを注入します。
4. マウスは免疫後の取り扱い
   1. 7日目に一日おきにマウスを計量し、その後、毎日それらの重量を量ります。
      注：マウスは約1失う - EAE間に体重を2g。減少は、EAEの発症をマーク。
   2. 7日目アコードから毎日臨床症状を評価します運動機能に明らかな変化を、0.5スコア：標準スコアリングシステムにる（ すなわち、スコア0ない尾の先端麻痺を;スコア1：完全な尾の麻痺を、1.5スコア：1または両方の後肢の軽度の不全麻痺;スコア2：後ろ足の深刻な麻痺;スコア2.5：1後肢の完全麻痺;スコア3：両方の後肢の完全麻痺; 3.5スコア：後肢と1前脚の麻痺の完全な麻痺が3.5以上のスコアのためにマウスを安楽死させます> 12時間。
5. EAEコースや撮影時
   1. 免疫後12 - マウスは10日目の周りに発生するスコア> 1に達したときに、疾患の発症時に最初の撮影を行います。
   2. 3日 - 初期症状が発症する1または2日後に到達され、1持続しますピーク時の第2の撮像を実行します。
      注：その後、マウスは完全に7〜10日以内に回復します。インターバル中のイメージングは​​、依然として、血管の漏れを示すことができますしかし、炎症の指標が負でなければなりません。

2.生物発光と視神経炎と脳炎症の近赤外イメージング

1. イメージング・システムのセットアップ
   1. 生物発光と近赤外信号の解析を可能にする機器をin vivoイメージングに行います。
   2. 全てのイメージング手順の間に2.5％イソフルラン麻酔 - 2の下にマウスを保管してください。
   3. 中央のガス供給を使用して、装置内で互いに横に位置1または2匹のマウス。中心部の上部脊椎を置きます。
   4. 薬の効果の評価は、ペアを比較するために、同時に2匹のマウス、グループごとに1つを使用してください。これは、生物発光イメージングのために重要です。
   5. 黒い布を用いた免疫化の部位を遮蔽し、マウス/マウスの正確な位置決めを評価するために写真とベースライン画像を取ります。すべての画像のためのカメラに6.5 cmの距離でB-フォーカスを使用してください。
2. 生物発光炎症プローブの注射とイメージング
   1. in vivoイメージングシステム設定を使用：8ビニングエピBLIは、エムがオープンフィルタリング、例のフィルタブロック、FSTOP 1、B = 6.5センチメートル、広告露出120秒を集中。ベースライン画像を取ります。
   2. すぐに使用できる化学発光試薬（40ミリグラム/ mL）を100μLの腹腔に注入します。注射器を充填する前によく混ぜます。
   3. 生物発光画像5、10、および注射後15分をキャプチャします。生物発光ピークの時間経過は、動物間で異なります。
      注：ピークは5発生します - 注射後の10分。 15分での減少はそれ以上の画像が必要とされないことを示しています。異なる時間のコースのためにマイナーなバイアスを排除するためにコントロール群と処置群のマウスのペアを使用してください。
   4. 実験に関連する説明を記入します。自動的にポップアップダイアログボックスを観察し、そのようなマウス系統、性別、時刻、プローブ注射、グループなどの時間などの情報を含みます。ファイルのすべての中のOを保存neのフォルダ;彼らは、時間タグとすべての記述があります。
3. BBBの整合性のための近赤外蛍光ナノ粒子の注射とイメージング
   1. B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。ペグ化蛍光ナノ粒子の励起/発光最大値は690分の675 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング2-のエクスポージャーを、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。
   2. 尾静脈を介してペグ化された蛍光赤外線ナノ粒子の70μLの静脈注入し、マウスを3時間と、上記の設定を使用して、注射後24時間を想像してみてください。注射器を充填する前に、溶液をよく混ぜます。
   3. シグナルの特異性を評価するために必要とされる対照マウスにおける0.9％塩化ナトリウム、注射。
4. 注入及びMMP活性の近赤外蛍光プローブのイメージング
   1. 剃るか、頭を脱毛するとuベースライン画像を撮影する前に、慎重に1日PPERの脊椎領域。皮膚が負傷してはいけません。
   2. B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。 MMPの活性化プローブの励起/発光最大値は700分の680 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング1-sの露出を、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。
   3. それは、10匹のマウスのために十分になるようにすぐに使用できる溶液（1×PBS中で20ナノモル/ 1.5 mL）を1.5 mLチューブに1×PBSの200μLを加えます。注射器を充填する前によく混ぜます。
      注：提供するボリュームは、いくつかのボリュームがシリンジ充填および注入中に失われていることを考慮に入れていません。
   4. 24時間イメージングの前に尾静脈を介してプローブivの150μLを注入します。シグナルの特異性を評価するためにのみ対照動物にPBSを注入します。
   5. 注射後24時間の時点で、少なくとも二つの波長、Ex640 / Em700および実施例675 / Eでエピ-FLの画像を撮影しますM720は、設定で（8、およびFSTOP 2ビニング1-sの露出、フォーカスB）上記で説明しました。
      注：2波長の使用は、非特異的シグナルを差し引くことによって、スペクトルアンミキシングを可能にします。

3.画像の解析

1. 生物発光分析（BLI）
   1. それを開くためにソフトウェアをダブルクリックします。
   2. 上部のメニューバーで、実験のフォルダのディレクトリに移動し、それを選択し、 ファイルブラウザのアイコンをクリックしてください。これは、テーブル内のフォルダ内のすべてのファイルを開きます。
   3. 実験に関連する記述を示す列を設定します。
   4. 品質管理のために、EAE信号の特異性を確認するために、EAEおよび/またはナイーブマウスの症状がなく、非レスポンダーマウスのファイルをダブルクリックします。
      注：非応答マウスではないナイーブマウスの信号と最小の信号があってはなりません。
      1. プロの注入前のベースライン画像をチェック信号の特異性のさらなる対照として、各マウスについてです。それが負でなければなりません。
   5. 画像を選択するには、最初のEAEマウスの最初のファイルをダブルクリックし、生物発光強度（LUTバー範囲）と局在を確認してください。すべての画像を一枚ずつ確認してください。各マウスの最安強度（ すなわち 、各マウスのための3つの画像のうち、2を保持）を使用してファイルを閉じます。
   6. 画像調整と輸出
      1. 定量化される最初のファイルをダブルクリックします。新しいウィンドウポップアップを確認します。 「オプション」（上部メニュー）の下では、各画像に表示するラベルをカスタマイズします。
      2. 右側のツールパレットでは、に行く「画像調整」。デフォルトでは、最小値と最大強度は、「オート」に設定されており、虹の擬似カラーで表示されています。必要に応じて設定を変更するには、「手動」を選択します。
         注：たとえば、エクスポートされたすべての画像が簡単に匹敵する同一のLUTバー（同一の最小値と最大値）を有していてもよいです。最小値と最大値の調整は、定量的な結果には影響しません。
      3. 画像のエクスポート、選択PNG形式、ディレクトリ、およびイメージ名をクリックして
   7. 関心領域の定量化（ROI）
      1. ツールパレットで「ROI」ツールに移動します。 ROI法（円、長方形、自動、また​​はフリーハンド）とROIの数を選択します。画像ウィンドウでポップアップROIウィンドウを確認します。
      2. マウスを使用して、サイズと位置を調整します。自動ROIツールを使用する場合は、すべての画像に対して同一のROIのしきい値を使用します。 ROIのサイズと位置を手動で（ 例えば、円形のROI）が定義されている場合は、すべての画像に対して同一の領域を使用してください。
      3. RO.I.が新しいウィンドウポップアップを観察し測定する」をクリックします。列をカスタマイズする（ 例えば、ファイル名、動物番号、グループ、実験、面積、総カウント、平均カウント、SD数、minとmaxはカウント、面積、時間ポイント、プローブ注入など ）の時間。カスタマイズされた設定を保存します。場合には、再ADYは、全てます（Ctrl + A）を選択し、スプレッドシートに表をコピーして貼り付けます。
      4. 代わりにROIを持つPNGなどの画像をエクスポートします。保存した画像ファイルを閉じます。
   8. 定量化する必要があるすべての画像ファイルのために - （3.1.7 3.1.6ステップ）の手順を繰り返します。スプレッドシートにすべてのROIの定量化をコピーします。
      注記：ここでは、結果等のグループ、時刻によってソートされ、統計的に分析することができます。統計分析のためのROIにおける生物発光シグナルの合計カウントを使用してください。
2. 蛍光ナノ粒子の近赤外（NIR）分析
   1. ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
      注：これは、定量的な結果には影響を与えません。
   2. 視覚信号の特異性を評価するために、EX /エム720分の675及びEX /エム700分の640で撮影した画像を比較します。
   3. 定量分析のためにEX /エム720分の675で撮影した画像を使用してください（最大励起：680 nm）を。自動ROIツールを使用することができるためのROIを規定します。自動ROIのしきい値を調整し、すべての画像のためにそれを使用しています。関心領域内の総放射効率を定量化する（ステップ3.1参照）。
3. プロテアーゼ感受性プローブの近赤外（NIR）分析
   1. ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
      注：これは、定量的な結果には影響を与えません。自家蛍光のスペクトルアンミキシングを行います。アンミキシングツールはイメージリビングに実装されます。自動アンミキシングは、自家蛍光画像などの特定および720分の675としてEX /エム700分の640を使用しています。
   2. 混合されていない画像を選択し、上記のように、関心領域を定義します。定量的および統計分析のためのROI内の総放射効率を使用してください。

結果

視神経炎の生物発光の時間コース

炎症プローブの生物発光信号は、目の周りの最も強かったと視神経炎でEAEマウスでのみ発生しました。信号は非EAEマウスや炎症プローブを注入していないマウスでもないに発生しました。マウスが回復したときに信号が消失しました。したがって、信号は、視神経炎に特異?...

ディスカッション

現在のビデオは、SJL / JマウスにおけるEAEのin vivoイメージングにおける生物発光と近赤外蛍光のための技術を示しています。我々は、炎症感受性プローブを用いた生物発光イメージングは​​、主に視神経炎を示し、そして定量化はEAEの重症度の臨床評価および薬物の効果と一致することを示します。信号は脊柱によって吸収されるためしかし、生物発光イメージング法は、お?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
Pertussis Toxin	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS analysis software
Isoflurane	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	Anaesthetic