Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme

Özet

Biz, in vivo canlı biyolüminesans ve yakın kızılötesi SJL / J farelerinde multipl skleroz için deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) modelinde optik nevrit ve ensefalit görüntüleme tekniğini göstermektedir.

Özet

SJL / J farelerde deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) tekrarlayan-düzelen multipl skleroz (RRMS) için bir modeldir. fonksiyon kayıpları tarif Klinik EAE puanları omurilik bağışıklık aracılıklı iltihaplanma temel okumalar vardır. Ancak, puanları ve vücut ağırlığı, beyin iltihabı ve optik nörit in vivo değerlendirilmesi için izin vermez. İkincisi yaklaşık 2/3 MS hastalarının erken ve sık bulgusudur. Burada, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak canlı farelerde biyolüminesans ve EAE optik nörit uyarılmış değerlendirmek için yakın kızıl ötesi canlı görüntüleme, beyin iltihabı ve kan-beyin bariyeri (KBB) bozulması için yöntemler göstermektedir. oksidazlar ile aktive olan bir biyolüminesens alt tabaka öncelikle optik nörit gösterdi. Sinyal özgü ve klinik skorları paralel ilaç etkileri ve hastalık süresi derslerin görselleştirme, izin verdi. vasculatur içinde kalmıştır pegile floresan nanopartiküllerUzun bir süre için, e KBB devamlılığını değerlendirmek için kullanıldı. Yakın-kızılötesi görüntüleme hastalığının zirvesinde BBB sızıntısı tespit edildi. Sinyal göz çevresindeki en güçlü oldu. Matris metaloproteinazların için yakın kızılötesi alt-tabaka EAE uyarılmış iltihabı değerlendirmek için kullanıldı. Otomatik floresans ölçümü için spektral Karışmama gerektiren sinyaline müdahale. Genel olarak, biyoparlaklık görüntüleme EAE ilişkili optik nevrit ve ilaç etkilerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem olduğunu ve sinyal özgüllük, sağlamlık, ölçme kolaylığı ve maliyet açısından yakın kızılötesi tekniklerden üstündü.

Giriş

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord¹. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries^2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors⁴ but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans⁵. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments⁶, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods⁷, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)⁸, and cathepsins⁹ or cyclooxygenase². These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis^9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE¹¹. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration¹², suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination¹³. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination¹⁴. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers⁵.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination^15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin⁵, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

Protokol

SJL 1. EAE İndüksiyon / J Fareler

1. fareler
   1. 11 haftalık dişi SJL / J fareler kullanın ve onları yaklaşık 7 gün boyunca deneysel odasına alıştırmak için izin verir. Grup başına n = 10 fare kullanın.
   2. ilaç etkilerinin değerlendirilmesi için, sürekli olarak içme suyu yoluyla ya da 3 ya da 5 gün Aşıdan sonra (n = 10 grup başına) başlangıç ​​gıda pelet yoluyla kontrol grubunda ilaç ve plasebo yönetmek. Hastalığın zirve sırasında, süt ya da% 3 şekerli su ile ıslatılmış mısır gevreği ile ilaç ya da plasebo yönetmek.
2. Aşılama malzemesi
   1. Tam Freund katkı maddesi (CFA, ısı ile öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) ve 2 şişeler (5 ug her biri) ile bir emülsiyon içinde bir EAE indüksiyon kiti antijenini içeren (proteolipid protein peptidi, PLP139-151, 1 mg / ml emülsiyon) kullanarak liyofilize boğmaca toksin (PTX).
   2. 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde PTX (2 ug / ml) (PBS içinde çözülür, yani, </ Em>), aynı bir pipet ucu ile kaldırma, iyice karıştırın ve 50 ml bir tüp içinde 1 mL PBS ile eklemek için, her PTX tüpüne PBS 1.5 mL eklemek; iyice karıştırın.
3. aşılama
   1. kuyruk dibinde, 2 kısım halinde, her 100 uL, her iki PLP / CFA deri altına enjekte edilir. Üst sırt ya da boyun deride herhangi bir immün reaksiyonlar baş ve omurilik görüntüleme rahatsız olacaktır, çünkü boyun arkasına enjekte etmeyin.
   2. aşılamadan sonra 2 saat ve 24 saat sonra ikinci - iki kez, fare başına intraperitonal PTX (ip), 100 uL, önce, 1 enjekte edilir.
   3. kontrol fareleri için, PLP olmadan PLP olmadan CFA (100 uL 2 porsiyon) artı PTX enjekte edilir.
4. Fare aşılama sonrası işleme
   1. farelere günde 7 her geçen gün yukarı tartılır ve daha sonra onları her gün tartın.
      NOT: Fareler yaklaşık 1 kaybetmek - EAE sırasında vücut ağırlığının 2 g. düşüş EAE başlangıcına işaret.
   2. gün 7 anlaşmanın günlük klinik semptomları değerlendirmekmotor fonksiyonlarda belirgin bir değişiklik; 0.5 puan: Standart skorlama sistemlerine ing (yani 0 Skor kuyruk distal felç; 1 puan: tam kuyruk paralizi; 1,5 puan: Bir veya her iki arka bacaklarda hafif parezi; 2 puan: arka ayakları şiddetli parezi; skoru 2.5: bir arka bacak tam paralizi; skoru 3: Her iki arka ayakları tam felç, 3.5 puan. arka ayakları ve bir ön bacak parezi tam felç 3.5 veya daha yüksek puanları ile fareler Euthanize > 12 saat.
5. EAE ders ve görüntüleme zamanı
   1. aşılamadan sonra 12 - fareler günde 10 civarında oluşacak puanları> 1, ulaştığınızda, hastalığın başlangıcında ilk görüntüleme gerçekleştirmek.
   2. 3 gün - ilk belirtileri gelişebilir sonra 1 ya da 2 gün ulaşılacaktır ve 1 sürecek zirve, ikinci görüntüleme gerçekleştirmek.
      NOT: Daha sonra, fareler tamamen 7 ila 10 gün içinde iyileşir. aralarda görüntüleme hala vasküler sızıntıları gösterebilirancak inflamasyon göstergeleri negatif olmalıdır.

2. Bioluminescent ve Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Yakın kızılötesi görüntüleme

1. Görüntüleme sisteminin Kur
   1. Biyolüminesans ve yakın kızılötesi sinyallerin analizi için izin veren herhangi bir ekipman ile in vivo görüntüleme gerçekleştirin.
   2. Tüm görüntüleme işlemleri sırasında% 2.5 izofluran anestezisi - 2 altında fareler tutun.
   3. Pozisyon bir veya orta gaz tedarikini kullanarak aygıtında yanyana iki fare. merkezde üst omurga yerleştirin.
   4. ilaç etkilerinin değerlendirilmesi çiftleri karşılaştırmak için, aynı anda iki fare, grup başına birini kullanın. Bu bio-ışıldar görüntüleme için önemlidir.
   5. siyah bezle bağışıklama siteyi kalkan ve fare / farelerin doğru konumlandırma değerlendirmek için bir fotoğraf ve temel görüntü almak. Tüm görüntüler için kameraya 6.5 cm mesafe ile B-odak kullanın.
2. Enjeksiyon ve biyolojik olarak ışık veren inflamasyon prob görüntüleme
   1. In vivo görüntüleme sistemi ayarları kullanın: 8 binning Epi-BLI, Em açık filtre, Ex filtre bloğu, fStop 1, B = 6.5 cm, reklam maruz kalma 120 s odak; temel bir görüntü çekmek.
   2. Hazır kullanımlı kemilüminesan bir reaktif (40 mg / ml), 100 uL ip enjekte edilir. şırınga doldurmadan önce iyice karıştırın.
   3. biyolüminesans görüntüleri 5, 10, ve enjeksiyon sonrası 15 dakika yakalayın. biyolüminesans zirve zaman ders hayvanlar arasında farklılık gösterir.
      NOT: pik 5 oluşacak - enjeksiyondan sonra 10 dakika; 15 dakika bir düşüş başka görüntüler gerekli olduğunu göstermektedir. nedeniyle farklı zaman kursları küçük önyargıları ortadan kaldırmak için kontrol ve tedavi grupları fare çiftleri kullanınız.
   4. deney ile ilgili açıklamalarda doldurun. otomatik olarak açılır bir iletişim kutusu gözlemlemek; Böyle fare suşu, cinsiyet, zaman noktasında, sonda enjeksiyon, grubun, vb gibi bilgileri içerir. Dosyaları tüm o kaydetne klasör; Onlar zaman etiketleri ve tüm açıklamaları olacaktır.
3. BBB bütünlüğü için yakın kızılötesi floresan nanopartiküller Enjeksiyon ve görüntüleme
   1. B-odak (6.5 cm mesafe) yakın-kızılötesi Epifloresans görüntüleme kullanın. pegile floresan nanopartiküllerin uyarma / emisyon maxima 675/690 nm. Ex640 / Em700 ve Ex675 / Em720 farklı dalga boylarında, iki görüntü yakalamak; 8 binning 2 s pozlama, kullanabilir ve fStop 2. bir temel görüntü çekin.
   2. kuyruk damar yoluyla pegile floresan kızılötesi nanopartiküllerin 70 mcL iv enjekte edilir ve fareler 3 saat ve üzeri ayarları kullanarak enjeksiyondan sonra 24 saat düşünün. şırınga doldurmadan önce çözüm iyice karıştırın.
   3. sinyalin özelliğini değerlendirmek için gerekli olacak kontrol farelerinde,% 0.9 sodyum klorür enjekte edilir.
4. Enjeksiyon ve MMP aktivitesi için yakın kızılötesi flüoresan probun görüntüleme
   1. Tıraş veya baş atmaktadır ve uBazal görüntüsünü almadan önce dikkatli bir gün pper omurga bölgesi. Cilt yaralı olmamalıdır.
   2. B-odak (6.5 cm mesafe) yakın-kızılötesi Epifloresans görüntüleme kullanın. MMP aktive edilebilir prob uyarım / emisyon maksimum 680/700 nm. Ex640 / Em700 ve Ex675 / Em720 farklı dalga boylarında, iki görüntü yakalamak; 8 kutulamanın 1-s maruz kullanımı ve fStop 2. Bir taban çizgisi görüntüsü al.
   3. 10 fareler için yeterli olacak şekilde hazır kullanım çözeltisi (1 x PBS içinde 20 nmol / 1.5 mL) içinde 1.5 mL bir tüpe 200 uL 1x PBS ilave et; şırınga doldurmadan önce iyice karıştırın.
      NOT: sağlanan hacim bazı ses şırınga doldurma ve enjeksiyon sırasında kaybolur dikkate almaz.
   4. görüntüleme önce kuyruk damar yoluyla 24 saat sonda iv 150 mcL enjekte edilir. sinyalin özelliğini değerlendirmek için tek kontrol hayvanlarında PBS enjekte edilir.
   5. enjeksiyondan 24 saat sonra, en az iki dalga boylarında, Ex640 / Em700 ve Ör 675 / E'de Epi-FL görüntüleri çekmekM720, ayarları (8 ve Fstop 2 binning 1-s pozlama odak B) Yukarıda açıklanan.
      NOT: İki dalga boyu kullanımı belirsiz sinyal çıkarılarak spektral unmixing sağlar.

3. Görüntü Analizi

1. Biyoparlaklık analizi (BLI)
   1. açmak için yazılım çift tıklatın.
   2. Üst menü çubuğunda, deney klasörün dizine gidin ve onu seçin, dosya tarayıcı ikonuna tıklayın; Bu tablodaki klasördeki tüm dosyaları açacak.
   3. deney ile ilgili açıklamalar gösteren sütunları yapılandırın.
   4. kalite kontrolü için, EAE sinyallerinin özgüllüğünü kontrol etmek EAE ve / veya naif fare semptomu olmayan bir yanıtsızlık fare dosyasına çift tıklayın.
      NOT: naif farelerde ve non-cevap farelerde az sinyal sinyal olmalıdır.
      1. pro enjeksiyonundan önce bazal görüntüyü kontrolsinyalin özgüllük daha kontrol olarak her fare için olacak; negatif olmalıdır.
   5. Bir görüntüyü seçmek için, ilk EAE fare ilk dosyasına çift tıklayın ve biyolüminesens yoğunluğunu (LUT çubuğu aralık) ve yerelleştirme kontrol edin. Tüm görüntüleri teker teker kontrol edin. Her fare için en düşük yoğunlukla dosyayı kapatın (yani, her fare için 2 out of 3 görüntüleri tutmak).
   6. Görüntü ayarı ve ihracat
      1. sayısal olarak ilk dosyasını çift tıklatın. Yeni bir penceresi açılır gözlemleyin. "Seçenekleri" (üst menü) altında, her görüntüde görüntülemek için etiketleri özelleştirebilirsiniz.
      2. Doğru aracı paletinde, gidin "görüntü ayarı." Varsayılan olarak, minimum ve maksimum şiddetleri "auto" olarak ayarlanır ve gökkuşağı Pseudocolor görüntülenir. Gerekirse ayarları değiştirmek için "el" i seçin.
         NOT: Örneğin, tüm ihraç görüntüleri aynı LUT çubukları (aynı minima ve maxima) olabilir kolayca karşılaştırılabilir olması.asgari ve azami ayarlanması nicel sonuçlar üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
      3. görüntü ihracat seçin png, dizin ve bir resim adını tıklayın
   7. İlgi Bölgeler miktarının belirlenmesi (YG)
      1. araç paletinde "ROI" aracı gidin. ROI yöntemi (daire, dikdörtgen, otomatik ya da serbest el) ve ROI sayısını seçin. ROI pencere görüntü penceresinde açılır gözlemleyin.
      2. Fareyi kullanarak, boyutunu ve konumunu ayarlamak. Otomatik ROI aracı kullanıldığı takdirde tüm görüntüler için aynı ROI eşikleri kullanın. YG boyutları ve konumları elle (örneğin, dairesel ROI) tanımlanmış olup olmadığını tüm görüntüler için aynı yerlerde kullanın.
      3. RO.I. yeni penceresi açılır gözlemleyin ölçmek "üzerine tıklayın. Sütunları özelleştir (örneğin, dosya adı, hayvan sayısı, grup, deney, alan, toplam sayım, ortalama sayısı, SD sayımı, min ve max sayar, alan, zaman nokta, sonda enjeksiyonu, vb) zamanı. özelleştirilmiş ayarları kaydedin. ne zaman yenidenady, bütün (Ctrl + A) seçin ve kopyalayıp bir elektronik tabloya tablo yapıştırın.
      4. yerinde ROI ile png görüntü olarak dışa aktarın. Kaydet ve görüntü dosyasını kapatın.
   8. sayısal gereken tüm resim dosyaları için - prosedürü tekrarlayın (3.1.7 3.1.6 adımlar). elektronik tabloya tüm ROI quantifications kopyalayın.
      NOT: Burada, sonuçları vb grubunda, zaman noktasında, sıralanabilir ve istatistiksel analiz edildi. istatistiksel analizler için ROI biyolüminesens sinyallerinin toplam sayılarını kullanın.
2. Floresan nanopartiküllerin Near-Infrared (NIR) analizi
   1. Yazılımda kontrolleri kullanarak, görüntünün eşiğini ayarlayın.
      NOT: Bu nicel sonuç üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.
   2. Görme sinyalin özelliğini değerlendirmek için Ex / Em 675/720 ve Ex / Em 640/700 çekilen görüntüleri karşılaştırın.
   3. kantitatif analiz için Ex / Em 675/720 yakalanan görüntüleri kullanın (uyarma maksimum: 680 nm). Otomatik ROI aracı kullanılabileceği için İB'leri, tanımlayın. Otomatik ROI eşiğini ayarlamak ve tüm görüntüler için kullanabilirsiniz. ROI toplam radyant verimlilik ölçmek (adım 3.1).
3. Proteaz duyarlı prob Near-Infrared (NIR) analizi
   1. Yazılım denetimlerini kullanma, görüntünün eşiğini ayarlayın.
      NOT: Bu nicel sonuç üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. otomatik floresans spektral Karışmama gerçekleştirin. Karışmama aracı Image Yaşayan uygulanmaktadır. Otomatik Karışmama otomatik floresan görüntü olarak özel ve 675/720 Ex / Em 640/700 kullanır.
   2. karışmamış görüntü seçin ve yukarıda açıklandığı gibi, ROI tanımlar. Nicel ve istatistiksel analizler için ROI toplam radyant verimlilik kullanın.

Sonuçlar

Optik nörit Bioluminescence Zaman Kursu

inflamasyon prob biyoparlaklık sinyal göz çevresindeki en güçlü ve optik nevrit EAE farelerde sadece oluştu. Bir sinyal olmayan EAE fareler ne de inflamasyon probu ile enjekte olmayan farelerde ne oluştu. fareler kurtarıldı zaman sinyal kayboldu. Bu nedenle, bir sinyal, optik nevrit özgüdür, ve sinyal tepe Klinik EAE puanları tepe paraleldir. Şeki...

Tartışmalar

Mevcut Video SJL / J farelerinde EAE in vivo görüntüleme biyolüminesans ve yakın kızılötesi floresan teknikleri göstermektedir. Biz bir enflamasyon duyarlı prob kullanılarak biyolüminesans görüntüleme esas optik nörit gösterir ve miktar EAE şiddetinin klinik değerlendirme ve ilaç etkileri ile uyumlu olduğunu göstermektedir. Sinyal omurga tarafından emilir Ancak, biyolüminesans görüntüleme yöntemi olasılıkla, EAE tezahürü ¹⁷ birincil site lomber spinal kord...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
Pertussis Toxin	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS analysis software
Isoflurane	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	Anaesthetic