Bioluminescence et proche infrarouge Imaging de névrite optique et inflammation du cerveau dans le modèle EAE de la sclérose en plaques chez des souris

Résumé

Nous montrons une technique de bioluminescence direct in vivo et l' imagerie dans l'infrarouge proche de la névrite optique et l' encéphalite dans le modèle expérimental d' encéphalomyélite auto - immune (EAE) pour la sclérose en plaques chez les souris SJL / J.

Résumé

Experimental encéphalomyélite auto-immune (EAE) dans SJL / J souris est un modèle pour la sclérose en plaques récurrente-rémittente (RRMS). scores EAE cliniques décrivant moteur déficits de fonction sont des lectures de base de l'inflammation de la médiation immunitaire de la moelle épinière. Toutefois, les scores et le poids corporel ne permettent pas une évaluation in vivo de l' inflammation du cerveau et de la névrite optique. Ce dernier est une manifestation précoce et fréquente dans environ 2/3 des patients atteints de sclérose en plaques. Ici, nous montrons des méthodes de bioluminescence et de l' imagerie en direct proche infrarouge pour évaluer EAE a évoqué la névrite optique, une inflammation du cerveau, et barrière hémato-encéphalique (BHE) perturbation chez les souris vivant en utilisant un système d'imagerie in vivo dans. Un substrat de bioluminescence activée par des oxydases a montré principalement la névrite optique. Le signal était spécifique et a permis la visualisation des effets des médicaments et des cours de temps de la maladie, qui en parallèle les scores cliniques. nanoparticules fluorescentes pégylés qui sont restés dans le vasculature pendant de longues périodes de temps ont été utilisés pour évaluer l'intégrité du Bureau. Proche infrarouge imagerie a révélé une fuite BBB au sommet de la maladie. Le signal est le plus fort autour des yeux. Un substrat proche de l'infrarouge pour métalloprotéinases de matrice a été utilisé pour évaluer l'inflammation de l'EAE évoquée. Auto-fluorescence interféré avec le signal, ce qui nécessite déconvolution spectrale pour la quantification. Dans l'ensemble, l'imagerie par bioluminescence est une méthode fiable pour évaluer la névrite optique et de médicaments effets EAE-associé et était supérieur aux techniques du proche infrarouge en termes de spécificité du signal, la robustesse, la facilité de quantification, et le coût.

Introduction

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord¹. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries^2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors⁴ but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans⁵. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments⁶, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods⁷, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)⁸, and cathepsins⁹ or cyclooxygenase². These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis^9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE¹¹. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration¹², suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination¹³. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination¹⁴. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers⁵.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination^15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin⁵, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

Protocole

1. EAE Induction dans SJL / J Souris

1. Souris
   1. Utilisez 11 semaines d'âge SJL femelle / souris J et leur permettre de se habituent à la salle expérimentale pendant environ 7 jours. Utilisez n = 10 souris par groupe.
   2. Pour l'évaluation des effets des médicaments, administrer le médicament et le placebo pour le groupe de contrôle en continu via l'eau de boisson ou par des boulettes de nourriture à partir de 3 ou 5 jours après l'immunisation (n = 10 par groupe). Durant le pic de la maladie, administrer un médicament ou un placebo avec du lait ou 3% de flocons de maïs sucre eau trempés.
2. Matériel de vaccination
   1. Utiliser un kit d'induction d'EAE comprenant l'antigène (peptide de la protéine protéolipide, PLP139-151, 1 mg / émulsion ml) dans une emulsion avec de l'adjuvant complet de Freund (CFA, Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur H37 Ra) et de 2 flacons (5 ug chacun) de la toxine de la coqueluche lyophilisée (PTX).
   2. Dissoudre la PTX (2 pg / ml) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS; par exemple, </ Em> ajouter 1,5 ml de PBS à chaque tube PTX, bien mélanger, retirer avec la même pointe de pipette, et ajouter à 1 ml de PBS dans un tube de 50 ml); bien mélanger.
3. Immunisation
   1. Injecter PLP / CFA voie sous-cutanée en 2 parties, chaque 100 pi, à la fois à la base de la queue. Ne pas injecter dans le dos du cou, car toutes les réactions immunitaires de la peau dans la partie supérieure du dos ou du cou perturberont imagerie de la tête et de la moelle épinière.
   2. Injecter 100 ul de PTX intrapéritonéale (ip), deux fois par souris, le 1 premier - 2 h après l'immunisation et la seconde à 24 h.
   3. Pour les souris témoins, injecter CFA sans PLP (2 portions de 100 pi) plus PTX sans PLP.
4. Souris manipulation après la vaccination
   1. Peser les souris tous les jours jusqu'au jour 7, puis peser tous les jours.
      REMARQUE: Les souris perdent environ 1 - 2 g de poids corporel au cours de l'EAE. La baisse marque le début de l'EAE.
   2. Évaluer les symptômes cliniques par jour du jour 7 accordment aux systèmes de notation standard (c. -à- score 0: pas de changements évidents dans les fonctions motrices; marquer 0,5: la paralysie distale de la queue; score 1: queue paralysie complète; marquer 1.5: parésie légère d'un ou les deux pattes de derrière; score 2: parésie sévère des pattes postérieures; marquer 2.5: paralysie complète d'une jambe de derrière, score 3: paralysie complète des deux pattes postérieures; marquer 3.5:. paralysie complète des pattes postérieures et parésie d'une jambe avant euthanasier les souris avec des scores de 3,5 ou plus pour > 12 heures.
5. EAE cours et le temps de l' imagerie
   1. Effectuer la première imagerie à l'apparition de la maladie, lorsque les souris atteignent des scores> 1, qui se produiront autour du jour 10-12 après la vaccination.
   2. Effectuer la deuxième imagerie au sommet, qui sera atteint 1 ou 2 jours après les premiers symptômes se développent et va durer pendant 1 - 3 jours.
      NOTE: Par la suite, les souris se rétablir complètement dans les 7 à 10 jours. Imaging pendant les intervalles peut encore montrer des fuites vasculaires,mais les indicateurs d'inflammation doivent être négatifs.

2. Bioluminescent et imagerie proche infrarouge de névrite optique et inflammation du cerveau

1. La configuration du système d'imagerie
   1. Effectuer l'imagerie in vivo avec tout équipement qui permet l'analyse de bioluminescence et de signaux dans le proche infrarouge.
   2. Garder la souris sous 2 à 2,5% d'isoflurane anesthésie pendant toutes les procédures d'imagerie.
   3. Position un ou deux souris à côté de l'autre dans l'appareil en utilisant les approvisionnements en gaz du milieu. Positionner la colonne vertébrale supérieure dans le centre.
   4. Utilisez deux souris simultanément, un par groupe, pour l'évaluation des effets des médicaments pour comparer des paires. Ceci est important pour l'imagerie bioluminescente.
   5. Protégez le site de la vaccination avec un chiffon noir et prendre une image photographique et de référence pour évaluer le positionnement correct de la souris / souris. Utiliser la mise au point B avec une distance de 6,5 cm à l'appareil pour toutes les images.
2. Injection et imagerie de la sonde d'inflammation bioluminescente
   1. Utilisez les paramètres in vivo dans des systèmes d'imagerie: Epi-BLI, Em filtre ouvert, Ex bloc de filtre, fstop 1, binning 8, concentrer B = 6,5 cm, ad exposition 120 s; prendre une image de référence.
   2. Injecter 100 ul IP du réactif chimioluminescent prêt à l'emploi (40 mg / ml). Bien mélanger avant de remplir la seringue.
   3. Capturer des images de bioluminescence 5, 10 et 15 min après l'injection. Le cours du temps du pic bioluminescente diffère entre les animaux.
      NOTE: Le pic se produira 5-10 min après l'injection; une baisse à 15 min indique qu'aucune autre images sont nécessaires. Utilisez des paires de souris des groupes de contrôle et de traitement pour éliminer les biais mineures dues à différents cours à temps.
   4. Remplissez les descriptions pertinentes à l'expérience. Observer une boîte de dialogue pop-up automatiquement; il comprend des informations, telles que la souche de la souris, le sexe, le point de temps, le temps d'injection de la sonde, le groupe, etc. Enregistrer les fichiers dans tous les odossier ne; ils auront des balises de temps et toutes les descriptions.
3. Injection et imagerie de nanoparticules fluorescentes proche infrarouge pour l' intégrité BBB
   1. Utilisez l'imagerie à épifluorescence proche infrarouge dans le B-focus (distance: 6,5 cm). Les maxima d'excitation / émission des nanoparticules fluorescentes pégylés sont 675/690 nm. Capturez deux images à différentes longueurs d'onde, à Ex640 / EM700 et Ex675 / Em720; utiliser un 2-s exposition, binning 8 et fstop 2. Prenez une image de référence.
   2. Injecter 70 ul de nanoparticules fluorescentes infrarouges pégylés iv à travers la veine de la queue et imaginer la souris 3 h et 24 h après l'injection en utilisant les paramètres ci-dessus. Mélangez bien la solution avant de remplir la seringue.
   3. Injecter chlorure de sodium à 0,9% chez les souris témoins, qui seront nécessaires pour évaluer la spécificité du signal.
4. Injection et imagerie de la sonde proche infrarouge fluorescent pour l' activité MMP
   1. Raser ou depilate la tête et upper région de la colonne vertébrale prudemment un jour avant de prendre l'image de référence. La peau ne doit pas être blessé.
   2. Utilisez l'imagerie à épifluorescence proche infrarouge dans le B-focus (distance: 6,5 cm). Les maxima d'excitation / émission de la sonde activable MMP sont 680/700 nm. Capturez deux images à différentes longueurs d'onde, à Ex640 / EM700 et Ex675 / Em720; utiliser un-s 1 exposition, binning 8 et fstop 2. Prenez une image de référence.
   3. Ajouter 200 ul de 1 x PBS dans le tube 1,5 ml de la solution prête à l'emploi (20 nmol / 1,5 ml dans 1 x PBS), de sorte qu'il sera suffisant pour 10 souris; bien mélanger avant de remplir la seringue.
      REMARQUE: Le volume disponible ne tient pas compte du fait que peu de volume est perdue au cours du remplissage de la seringue et l'injection.
   4. Injecter 150 ul de la iv sonde à travers la veine de la queue 24 h avant l'imagerie. Injecter du PBS seulement chez les animaux de contrôle pour évaluer la spécificité du signal.
   5. A 24 h après l'injection, prendre des images Epi-FL au moins deux longueurs d'onde, Ex640 / EM700 et Ex 675 / EM720, avec les paramètres expliqué ci-dessus (1-s exposition, mise au point B, binning 8 et fstop 2).
      NOTE: L'utilisation de deux longueurs d'onde permet de déconvolution spectrale en soustrayant le signal non spécifique.

3. Analyses image

1. L' analyse par bioluminescence (BLI)
   1. Double-cliquez sur le logiciel pour l'ouvrir.
   2. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur l'icône du navigateur de fichier, allez dans le répertoire du dossier de l'expérience, et sélectionnez - le; cela va ouvrir tous les fichiers dans le dossier dans une table.
   3. Configurer les colonnes montrant les descriptions pertinentes à l'expérience.
   4. Pour le contrôle de la qualité, double-cliquez sur un fichier d'une souris non-répondeur sans symptômes de l'EAE et / ou une souris naïve pour vérifier la spécificité des signaux EAE.
      NOTE: Il devrait y avoir aucun signal dans des souris naïves et le signal minimal chez les souris non-répondeurs.
      1. Vérifiez l'image de référence avant l'injection de la prosoit pour chaque souris en tant que contrôle supplémentaire de la spécificité du signal; il devrait être négatif.
   5. Pour sélectionner une image, double-cliquez sur le premier fichier de la première souris EAE et vérifier l'intensité bioluminescente (LUT gamme de bar) et la localisation. Vérifiez toutes les images une par une. Fermez le fichier avec l'intensité la plus faible pour chaque souris (ie, garder 2 sur 3 images pour chaque souris).
   6. l'ajustement et l'exportation image
      1. Double-cliquez sur le premier fichier à quantifier. Observez une nouvelle fenêtre pop up. Sous "options" (menu supérieur), personnaliser les étiquettes à afficher dans chaque image.
      2. Dans la palette d'outils à droite, aller à "Réglage de l'image." Par défaut, les intensités minimales et maximales sont réglées sur "auto" et affichés dans rainbow pseudocolor. Sélectionnez "manuel" pour modifier les paramètres si nécessaire.
         NOTE: Par exemple, toutes les images exportées peuvent avoir des barres de LUT identiques (minima et maxima identiques) pour être facilement comparables.L'ajustement des minima et maxima n'a aucun impact sur les résultats quantitatifs.
      3. Cliquez sur l'image à l'exportation, sélectionnez png, le répertoire et un nom d'image
   7. Quantification des régions d'intérêt (ROI)
      1. Aller à la "ROI" outil dans la palette d'outils. Sélectionnez la méthode de ROI (cercle, rectangulaire, auto ou mains libres) et le nombre de ROIs. Observez la fenêtre de ROI pop up dans la fenêtre d'image.
      2. Avec la souris, ajuster la taille et la position. Utilisez des seuils de ROI identiques pour toutes les images si l'outil d'auto-ROI est utilisé. Utilisez des zones identiques pour toutes les images si tailles et positions ROI sont définies manuellement (par exemple, ROIs circulaires).
      3. Cliquez sur "mesurer RO.I. Observer une nouvelle fenêtre pop - up. Personnalisez les colonnes (par exemple, le nom du fichier, le nombre d'animaux, le groupe, l' expérience, la superficie, les comptages totaux, comptes moyens, le nombre de SD, min et max Chiffres, région, temps le point, le temps d'injection de la sonde, etc.). Enregistrer les paramètres personnalisés. Lorsque ready, tout sélectionner (Ctrl + A), et copier et coller le tableau dans une feuille de calcul.
      4. Exporter l'image comme png avec les ROIs en place. Enregistrer et fermer le fichier image.
   8. Répétez la procédure (étapes 3.1.6 - 3.1.7) pour tous les fichiers d'image qui doivent être quantifiés. Copiez tous les quantifications de retour sur investissement dans le tableur.
      NOTE: Ici, les résultats peuvent être triés par groupe, point de temps, etc. et analysées statistiquement. Utilisez les comptes totaux de signaux de bioluminescence dans le ROIs pour les analyses statistiques.
2. (NIR) analyse infrarouge Près de nanoparticules fluorescentes
   1. Utilisation des commandes dans le logiciel, régler le seuil de l'image.
      NOTE: Cela n'a aucun impact sur le résultat quantitatif.
   2. comparer visuellement les images capturées à Ex / Em 675/720 et Ex / Em 640/700 pour évaluer la spécificité du signal.
   3. Utilisez les images capturées à Ex / Em 675/720 pour l'analyse quantitative (maximum d'excitation: 680 nm). Définir ROIs, pour lequel l'outil d'auto-ROI peut être utilisé. Réglez le seuil d'auto-ROI et de l'utiliser pour toutes les images. Quantifier l'efficacité radiante totale dans ROIs (voir étape 3.1).
3. (NIR) analyse-proche infrarouge de la sonde sensible à une protéase
   1. Utilisation des commandes de logiciels, régler le seuil de l'image.
      NOTE: Cela n'a aucun impact sur le résultat quantitatif. Effectuer unmixing spectrale de l'auto-fluorescence. L'outil unmixing est mis en œuvre Living Image. L'auto-unmixing utilise Ex / Em 640/700 comme spécifique et 675/720 en tant que l'image de l'auto-fluorescence.
   2. Sélectionnez l'image unmixed et définir les ROIs, comme décrit ci-dessus. Utilisez l'efficacité rayonnante totale dans ROIs pour des analyses quantitatives et statistiques.

Résultats

Cours Temps de bioluminescence de névrite optique

Le signal de bioluminescence de la sonde de l'inflammation a été la plus forte autour des yeux et est produite exclusivement chez des souris EAE avec névrite optique. Un signal a été dans ni les souris non-EAE, ni les souris non injectées avec la sonde de l'inflammation. Le signal a disparu lorsque la souris récupéré. Par conséquent, le signa...

Discussion

La présente vidéo montre les techniques de la bioluminescence et la fluorescence dans le proche infrarouge dans l' imagerie in vivo de l' EAE chez les souris SJL / J. Nous montrons que l'imagerie par bioluminescence à l'aide d'une sonde sensible à l'inflammation montre principalement la névrite optique et la quantification en accord avec l'évaluation clinique de l'EAE et la sévérité des effets des médicaments. Cependant, le procédé d'imagerie par biolumin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
Pertussis Toxin	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS analysis software
Isoflurane	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	Anaesthetic