Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

Resumo

Mostramos uma técnica para in vivo bioluminescência vivo e no infravermelho próximo de imagem de neurite óptica e encefalite no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) para a esclerose múltipla em ratinhos SJL / J.

Resumo

Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) em murganhos SJL / J é um modelo para a esclerose múltipla recorrente-remitente (EMRR). pontuações de EAE clínica que descrevem os défices de função de motor são leituras básicas da inflamação mediada por imune da medula espinhal. No entanto, a pontuação e peso corporal não permitem uma avaliação in vivo de inflamação do cérebro e neurite óptica. O último é uma manifestação precoce e frequente em cerca de 2/3 dos pacientes com EM. Aqui, mostramos métodos para a bioluminescência e imagens ao vivo do infravermelho próximo para avaliar EAE evocado neurite óptica, inflamação do cérebro, e barreira sangue-cérebro interrupção (BBB) em ratos vivos utilizando um sistema de imagem in vivo. Um substrato bioluminescente activado por oxidases mostrou principalmente neurite óptica. O sinal foi específico e permitiu a visualização de efeitos da medicação e cursos tempo de doença, que em paralelo os escores clínicos. nanopartículas fluorescentes peguilados que permaneceram dentro da vasculature por períodos de tempo prolongados foram usadas para avaliar a integridade da BHE. No infravermelho próximo de imagem revelou uma fuga de certificação no pico da doença. O sinal foi mais forte em torno dos olhos. Um substrato de infravermelho próximo para metaloproteinases de matriz foi usada para avaliar a inflamação evocados-EAE. Auto-fluorescência interferiu com o sinal, o que requer a separação espectral para efeitos de quantificação. Em geral, imagem de bioluminescência foi um método fiável para avaliar a neurite óptica e efeitos de medicação associada a EAE e foi superior ao das técnicas de infravermelho próximo, em termos de especificidade do sinal, robustez, facilidade de quantificação, e custo.

Introdução

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord¹. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries^2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors⁴ but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans⁵. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments⁶, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods⁷, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)⁸, and cathepsins⁹ or cyclooxygenase². These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis^9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE¹¹. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration¹², suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination¹³. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination¹⁴. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers⁵.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination^15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin⁵, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

Protocolo

1. EAE Indução em SJL / J Mice

1. Ratos
   1. Use camundongos 11 semanas de idade SJL Mulher / J e permitir-lhes para se habituar à sala experimental durante cerca de 7 dias. Utilize n = 10 ratos por grupo.
   2. Para a avaliação dos efeitos da medicação, administrar a droga e placebo para o grupo de controlo continuamente através da água de beber ou através de peletes alimentares a partir de 3 ou 5 dias após a imunização (n = 10 por grupo). Durante o pico da doença, administrar medicação ou placebo com leite ou 3% flocos de milho-embebidas água com açúcar.
2. material de imunização
   1. Utilizado um kit de indução de EAE que compreende o antigénio (péptido da proteína proteolipídica, PLP139-151, 1 mg / ml de emulsão) em uma emulsão com adjuvante de Freund completo (CFA, morta pelo calor de Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 frascos para injectáveis ​​(5 ug cada) de toxina da tosse convulsa liofilizado (PTX).
   2. Dissolve-se a PTX (2 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS; isto é, </ Em> adicionar 1,5 mL de PBS a cada tubo de PTX, misturar bem, remover com a mesma ponta de pipeta, e adicionar a 1 mL de PBS num tubo de 50 mL); misture bem.
3. Imunização
   1. Injectar PLP / CFA por via subcutânea em 2 porções, cada uma de 100 ul, tanto na base da cauda. Não injectar na parte de trás do pescoço, porque quaisquer reacções imunitárias na pele na parte superior das costas ou no pescoço vai perturbar a imagem da cabeça e da medula espinhal.
   2. Injectar 100 uL de PTX por via intraperitoneal (IP), duas vezes por ratinho, o primeiro 1-2 h após a imunização e a segunda a 24 h.
   3. Para os ratos de controlo, injectar CFA sem PLP (2 porções de 100 mL) mais PTX, sem PLP.
4. Rato manuseamento após a imunização
   1. Pesar os ratos a cada dois dias até ao dia 7, e, em seguida, pesá-los diariamente.
      NOTA: Ratos perder cerca de 1-2 g de peso corporal durante a EAE. O declínio marca o início de EAE.
   2. Avaliar os sintomas clínicos diariamente desde o dia 7 de acordoing aos sistemas de pontuação padrão (ou seja, a pontuação 0: sem mudanças óbvias em funções motoras; marcar 0,5: paralisia distal da cauda; marcar 1: paralisia da cauda completa; marcar 1,5: paralisia leve de uma ou ambas as patas traseiras; marcar 2: grave paralisia das patas posteriores; marcar 2,5: paralisia completa uma perna; marcar 3: paralisia completa das duas patas traseiras; marcar 3.5:. paralisia completa dos membros posteriores e paresia de uma perna dianteira Euthanize camundongos com dezenas de 3.5 ou superior para > 12 h.
5. Claro e hora da imagem EAE
   1. Realizar a primeira imagem no início da doença, quando os ratinhos atingir pontuações> 1, que vai ocorrer por volta do dia 10-12 após a imunização.
   2. Realizar a segunda imagem no pico, que vai ser atingido 1 ou 2 dias após os sintomas iniciais desenvolver e vai durar durante 1 - 3 dias.
      Nota: Subsequentemente, os ratos recuperar totalmente dentro de 7 a 10 dias. De imagem durante os intervalos ainda pode mostrar fugas vasculares,mas os indicadores de inflamação deve ser negativo.

2. Bioluminescent and Imaging Near-infrared de neurite óptica e Cérebro Inflamação

1. Configuração do sistema de imagem
   1. Realiza-se em imagiologia in vivo com qualquer equipamento que permite a análise de bioluminescência e sinais do infravermelho próximo.
   2. Manter os ratos com menos de 2 - anestesia isoflurano 2,5% durante todos os procedimentos de imagem.
   3. Posição um ou dois ratos ao lado do outro no aparelho usando os fornecimentos de gás média. Posicionar a parte superior da coluna no centro.
   4. Use dois ratos simultaneamente, um por grupo, para a avaliação dos efeitos de medicação para comparar pares. Isto é importante para a imagiologia bioluminescente.
   5. Proteger o local da imunização com um pano preto e tomar uma imagem de fotografia e de linha de base para avaliar o posicionamento correto do mouse / mice. Use o foco B com um 6,5-cm de distância da câmera para todas as imagens.
2. Injeção e imagem da sonda inflamação bioluminescente
   1. Use in vivo configurações do sistema de imagem: Epi-BLI, Em filtrar aberta, Ex bloco de filtro, fstop 1, binning 8, o foco B = 6,5 cm, anúncio de exposição 120 s; dar uma imagem de linha de base.
   2. Injectar 100 uL IP do reagente quimioluminescente pronto-para-uso (40 mg / mL). Misture bem antes de encher a seringa.
   3. Capturar imagens bioluminescência 5, 10, e 15 minutos após a injeção. O decurso de tempo do pico bioluminescente difere entre animais.
      NOTA: O pico ocorrerá 5 - 10 minutos após a injecção; um declínio de 15 min indica que não há imagens adicionais são necessários. Utilize pares de ratos com grupos de controle e tratamento para eliminar preconceitos menores devido a diferentes intervalos de tempo.
   4. Preencher descrições relevantes para o experimento. Observar uma caixa de diálogo pop-up automaticamente; que inclui informações, como estirpe de ratinhos, sexo, ponto de tempo, o tempo de injeção de sonda, o grupo, etc. Salve os arquivos de todos em One pasta; eles vão ter marcas de tempo e todas as descrições.
3. Injeção e imagem de nanopartículas fluorescentes do infravermelho próximo para a integridade BBB
   1. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão das nanopartículas fluorescentes peguilados são 675/690 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar a 2 s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
   2. Injectar 70 mL de nanopartículas infravermelhos fluorescentes peguilados IV através da veia da cauda e imaginar os ratos 3 h e 24 h após a injecção utilizando as definições acima. Misture bem a solução, antes de encher a seringa.
   3. Injectar cloreto de sódio a 0,9% em ratinhos de controlo, que irá ser necessário para avaliar a especificidade do sinal.
4. Injeção e de imagem da sonda de infravermelho próximo fluorescente para a atividade MMP
   1. Barbear ou depilar a cabeça e uregião da coluna pper cautela um dia antes de tomar a imagem de linha de base. A pele não deve ser ferido.
   2. Use imagens de epifluorescência infravermelho próximo no foco B (distância de 6,5 cm). Os máximos de excitação / emissão da sonda activ�el MMP são 680/700 nm. Capturar duas imagens em diferentes comprimentos de onda, em Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; usar um 1-s de exposição, binning 8 e fstop 2. Tome uma imagem de linha de base.
   3. Adicionar 200 ul de 1x PBS para o tubo de 1,5 ml da solução de pronto-a-usar (20 nmol / 1,5 ml em PBS 1x), de modo que vai ser suficiente para 10 ratinhos; misturar bem antes de encher a seringa.
      NOTA: O volume fornecido não leva em conta que algum volume é perdido durante o enchimento de seringa e injeção.
   4. Injectar 150 mL da sonda IV através da veia da cauda 24 horas antes da imagiologia. Injectar PBS apenas em animais de controlo para avaliar a especificidade do sinal.
   5. Às 24 h após a injeção, tome imagens Epi-FL, pelo menos, em dois comprimentos de onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, com as configurações explicado acima (1-s exposição, a focagem B, binning 8 e fstop 2).
      NOTA: O uso de dois comprimentos de onda permite a separação espectral subtraindo o sinal não específico.

3. As análises da imagem

1. Análise de bioluminescência (BLI)
   1. Clique duas vezes no software para abri-lo.
   2. Na barra de menu superior, clique no ícone do navegador de arquivos, vá para o diretório da pasta do experimento, e selecione-o; isso vai abrir todos os arquivos na pasta em uma tabela.
   3. Configurar as colunas mostram as descrições relevantes para o experimento.
   4. Para controle de qualidade, clique duas vezes em um arquivo de um rato não responder, sem sintomas de EAE e / ou um rato naïve para verificar a especificidade dos sinais de EAE.
      NOTA: Não deve haver nenhum sinal em camundongos ingênuos e sinal mínimo em ratos não responderam.
      1. Verifique a imagem de linha de base antes da injeção do proser para cada rato como um controlo posterior da especificidade do sinal; ele deve ser negativo.
   5. Para selecionar uma imagem, clique duas vezes no primeiro arquivo do primeiro rato EAE e verificar a intensidade bioluminescente (LUT gama bar) e localização. Verifique todas as imagens uma a uma. Feche o arquivo com a menor intensidade para cada rato (ou seja, mantenha 2 de 3 imagens para cada mouse).
   6. ajuste de imagem e exportação
      1. Clique duas vezes no primeiro arquivo a ser quantificado. Observar uma nova janela pop-up. Em "Opções" (menu superior), personalizar os rótulos para exibir em cada imagem.
      2. Na paleta ferramenta certa, ir para "ajuste de imagem." Por padrão, as intensidades mínimas e máximas estão definidas para "auto" e exibido em pseudo arco-íris. Selecione "manual" para alterar as configurações, se necessário.
         NOTA: Por exemplo, todas as imagens exportadas pode ter barras de TUS idênticos (minima idênticos e maxima) para ser facilmente comparáveis.O ajuste dos mínimos e máximos não tem impacto sobre os resultados quantitativos.
      3. Clique na exportação de imagens, selecione png, o diretório e um nome de imagem
   7. Quantificação de regiões de interesse (ROI)
      1. Ir para a função "ROI" na paleta de ferramentas. Selecione o método de ROI (círculo, rectangular, auto, ou free-hand) eo número de ROIs. Observe a janela de ROI aparecer na janela da imagem.
      2. Usando o mouse, ajustar o tamanho e posição. Use limiares de ROI idênticos para todas as imagens se a ferramenta de auto-ROI é usado. Use áreas idênticas para todas as imagens se os tamanhos e posições de ROI são definidos manualmente (por exemplo, ROI circular).
      3. Clique em "medir RO.I. Observar uma nova janela pop-up. Personalize as colunas (por exemplo, nome do arquivo, o número de animais, o grupo, experiência, área, as contagens totais, contagens médias, contagens SD, min e max conta, área, tempo ponto, o tempo de injeção de sonda, etc.). Salve as configurações personalizadas. Quando reAdy, selecione tudo (Ctrl + A), e copiar e colar a tabela em uma planilha.
      4. Exportar a imagem como um png com as ROIs no lugar. Salve e feche o arquivo de imagem.
   8. Repita o procedimento (etapas 3.1.6 - 3.1.7) para todos os arquivos de imagem que precisam ser quantificados. Copie todos quantificações de ROI na planilha.
      NOTA: Aqui, os resultados podem ser classificados por grupo, ponto de tempo, etc. e analisados estatisticamente. Use as contagens totais de sinais de bioluminescência na ROIs para análises estatísticas.
2. Análise de infravermelho próximo (NIR) de nanopartículas fluorescentes
   1. Usando os controles no software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo.
   2. comparar visualmente as imagens capturadas no Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 para avaliar a especificidade do sinal.
   3. Use as imagens capturadas pelo Ex / Em 675/720 para a análise quantitativa (máximo de excitação: 680 nm). Definir ROIs, para o qual pode ser utilizado a ferramenta de auto-ROI. Ajuste o limite auto-ROI e usá-lo para todas as imagens. Quantificar a eficiência radiante total na ROIs (veja o passo 3.1).
3. Análise de infravermelho próximo (NIR) da sonda sensível a protease
   1. Usando controles de software, ajustar o limite da imagem.
      NOTA: Isto não tem qualquer impacto sobre o resultado quantitativo. Realizar a separação espectral do auto-fluorescência. A ferramenta desmistura é implementado em Imagem estar. A auto-desmistura usa o Ex / Em 640/700 como o específico e 675/720 como a imagem auto-fluorescente.
   2. Seleccionar a imagem não misturados e definir os ROIs, como descrito acima. Use a eficiência radiante total na ROIs para as análises quantitativas e estatísticas.

Resultados

Curso de tempo de bioluminescência de neurite óptica

O sinal da sonda de bioluminescência inflamação era a mais forte em torno dos olhos e ocorreu exclusivamente em ratinhos EAE com neurite óptica. Um sinal ocorreu em nenhum dos ratinhos não-EAE nem os ratinhos não injectados com a sonda de inflamação. O sinal desapareceu quando os ratos recuperaram. Assim, o sinal é específico para a neurite ópti...

Discussão

A presente vídeo mostra técnicas de bioluminescência e fluorescência no infravermelho próximo imagiologia in vivo de EAE em ratinhos SJL / J. Mostramos que imagem de bioluminescência utilizando uma sonda sensível à inflamação mostra principalmente a neurite óptica, e a quantificação está de acordo com a avaliação clínica da gravidade da EAE e os efeitos do medicamento. No entanto, o método de imagem de bioluminescência não foi capaz de detectar a inflamação da medula espinal lombar, que é...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
Pertussis Toxin	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS analysis software
Isoflurane	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	Anaesthetic