鼠左前降支（LAD）冠状动脉结扎:改进和简化模型的心肌梗死

摘要

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

摘要

缺血性心脏疾病（IHD），或急性冠脉综合征（ACS），是死亡的在美国的主要原因之一。 IHD的特征在于血液供应减少到心脏，导致氧气的损失和心脏肌肉的随后的坏死。该MI模型已经得到普及其作为短期缺血再灌注模型和一个长期的永久的结扎模型使用。下面，我们描述了LAD的结扎的可靠方法。随着鼠标基因工程技术变得越来越先进，并与质量鼠手术器械的日益普及，鼠标已经成为MI手术的热门机型。我们的手术模型包括使用对鼠标的快速恢复的易可逆麻醉剂;微创气管内插管，而不涉及气管切开术;并通过原开胸部位的胸腔而不在胸部额外的切口，如在一些其他方法来完成，从胸腔至有效地去除过量的血液和空气。此方法相对比其它方法，这极大地减少了外科手术和外科手术后的并发症和死亡率及改善再现性侵入性更小。

引言

冠状动脉疾病，或ACS，是最常见的心血管事件，将被认为是发病率和死亡率世界各地的主要原因在2020年^1。 ACS的原因是心肌血栓的存在由于冠状动脉粥样硬化斑块，阻止或减少血液流向心脏组织²的破裂。因此，有临床症状的急性心肌缺血的存在一致，如心肌梗死^{（MI）3,4。} MI导致心肌细胞的质量损失和进展为病理性心室重构，从而导致心功能不全和心脏衰竭^5,6。

其中一个最有效的方法来研究IHD一直模仿人类心肌梗死的动物模型。这是由闭塞的LAD实现老鼠。使用这个模型，我们研究如何心脏可以从IHD造成的损害进行保护。

在过去的十年中，研究人员使用较大的动物模型，以较小的动物，包括大鼠小鼠移位移动。较小的小鼠模型开始被优选的原因很多，其中包括它们的小尺寸，大产仔数，维护成本低，和短的怀孕期，以及用于转基因和基因敲除模型⁷的膨胀可用性。虽然小鼠体积小，专为他们设计的新的手术器械已经在这方面的发展援助。我们的方法利用这些新的手术器械。

虽然一些方法来实现的侵入气管切开术，我们使用气管插管的微创方法。使用口咽开销照明，我们插管不会造成任何切口，提供T A更安全，创伤小经验他的动物。然后将鼠标放置在呼吸机和在整个过程中保持在异氟醚。由于药物产生的麻醉时间短，只需要几分钟，让动物从麻醉一旦停产恢复。我们的手术模型还包括微创胸腔穿刺。从胸腔胸腔穿刺术使用仔细取出血液和过量空气通过原开胸切口已经解决了LAD结扎的共同术后并发症:张力气胸。该方法中，这消除了在其它方法中，一个用于气管切开术，另一个用于胸腔-已经产生了更少的外科手术后的并发症中使用的两个附加的切口的需要，并大幅度降低了死亡率。

研究方案

这种动物的协议已经通过审查，机构动物护理和使用委员会（IACUC）在罗德岛医院批准。

1.麻醉插管

1. 称重鼠标来计算手术后止痛药的用量。
2. 鼠标放置在感应腔室，并提供4％异氟烷9 - 10分钟，监测整个动物。打开热珠灭菌，使得该装置可以预热到约250℃。预热需要15 - 20分钟。
3. 一旦小鼠达到麻醉的深平面，具有大约32次呼吸/分钟的呼吸速度，放置在泡沫聚苯乙烯板鼠标仰卧和使用顶部门齿下固定的弹性带保持嘴巴张开。通过执行脚趾掐确认镇静。使得口咽可以显现高强度照明鼠标在上面进行定位。
4. 使用弯钳打开颚和另一对钳解除舌头的方式。一定要插管，而位于或略低于眼水平的小鼠的身体。推荐使用手术放大镜的。
5. 可视化声带的开启和关闭。当打开时，插入20号，1-在静脉内（IV）导管用钝尖针导引器。使用针，引导导管至气管开口，但要避免将针插入气管。正确位置的验证可以使用塑料移液管来完成。
6. 所述插管小鼠转移到配备有加热装置的操作表面。将鼠标连接到一个小动物呼吸机设置为150μL/冲程的冲程容积为130个冲程/分钟的行程速度。
7. 交付2.5％的异氟醚。通过检查双侧挺胸抬头验证插管。通过执行脚趾掐确认的麻醉。鼠标可能需要5 - 呼吸机10分钟才能完全麻醉。

2。准备鼠标

1. 胶带向下在呼吸机和IV导管之间的连接部位的插管。大盘回落的四肢。广场上的眼睛无菌润滑油滴。
2. 修剪胸廓的腹侧左侧用电动剃刀。将灰尘从剃毛皮用干擦拭物，并使用无菌棉签申请的脱毛膏一小层。霜剂应保持与毛囊约30联系人 - 45秒。
3. 虽然霜过程，放置3个无菌棉签在三个1.5毫升的管中填充有优碘浸泡。用蘸有蒸馏水纸巾，轻轻擦去奶油和皮毛。
4. 清洁外科领域三次，交替聚维酮碘和无菌70％的异丙醇制备垫，清洗在从中心移动到外周的圆周运动。将无菌悬垂超过鼠标的外科手术领域的四分之一大小的洞。
5. 清理周围的谅解备忘录的区域e为70％的乙醇。验证与脚趾捏一次麻醉。

3. LAD结扎

1. 置于热珠灭菌蒸压手术器械预热至250℃下进行约20秒。放在无菌高压加热的手术铺巾的无菌器械。唐手术手套。
2. 用细尖镊子轻轻地在一个点大约5 mm提升肌肤突出剑突软骨的左侧。使用手术刀用10号刀片从这个点上创建的皮肤切口垂直向上，以胸骨柄的水平。
3. 使用弯钳皮肤和肌肉层轻轻分开。打开肌肉层，下面的皮肤切口。穿过肌肉层，一个在切口两侧插入两个5-0聚丙烯缝线，并用夹子固定保持肌肉层开放暂时固定缝合。
4. 识别，并在第三肋间切口，继胸腔的自然角。从鼠标的左侧末端取下胶带和左后脚固定到其右后脚用胶带。切割较长的胶带片和在稍微升高的位置其左侧前脚固定到操作表面。清洁用70％乙醇的手套。
5. 使用牵开器轻轻拨开3 ^{和 第} 4肋骨。切无菌纱布的一小部分，以x½在大约1，并在无菌0.9％盐水蘸。挤出多余的盐水并使用镊子轻轻插入纱布针对左肺，以防止在手术过程中偶然的肺损伤。
6. 轻轻取出薄心包用钳子。
7. 撕裂棉少量断无菌棉签把它卷成小球。这浸的棉花球到0.9％的无菌生理盐水轻轻擦拭心脏的表面上欣赏到动脉。轻轻向上推起左耳廓和定位下的冠状动脉尼思。
8. 识别LAD并通过LAD下8-0尼龙缝线;完成两个单结，确保结扎。如果连接成功，从结扎意志灼左心室远端。
9. 使用镊子，删除之前插入的纱布，然后轻轻取出牵引器。插入连接于25号针插入通过开胸开口胸腔6中，25号柔性管。推进约1 - 2在管道的进左肺上方的空间。返回鼠标仰卧位置和清洁用70％乙醇的手套。
10. 使用一个简单的中断模式5-0聚丙烯缝合关闭胸腔，保持胸腔引流管到位。取下两条缝合线保持肌肉层开放。使用在一个简单的连续图案5-0聚丙烯缝合关闭肌肉层，再次保持胸管就位。
11. 附加的1毫升注射器，以在胸部管25号针头。轻轻向上拉急跌ř同时逐渐提取胸腔用镊子胸管。提取管缓慢，因为这步骤除去过量的空气和血液，否则将被捕获到胸腔和结果在气胸。
12. 一旦注射器是满的，从针取下注射器，并在浪费烧杯或水槽的垃圾处置。继续这个过程，直到胸管被完全萃取。确保胸部紧密地密封。
13. 降低异氟醚1.5％。关闭与4-0聚丙烯缝合皮肤在简单的中断模式。关闭异氟醚蒸发掉。
14. 通过腹膜内（IP）注射施用0.9％盐水中0.1毫克/毫升的丁丙诺啡。在0.9％的盐水局部施用2毫克/毫升利多卡因用2毫克/毫升布比卡因的切口。通过皮下注射μL0.9％盐水500，缩放盐水量到鼠标的重量 - 管理200之间。
15. 等待ADMINI后5分钟stering的止痛药，以除去从插管鼠标。这有助于关闭呼吸机的过渡。
    1. 如果鼠标没有一个双边挺胸抬头，一旦关闭呼吸机，进行穿刺减压。要做到这一点，引入一个25号无菌针和3 ^{和 第} 4肋骨间的1毫升注射器，直到它进入胸腔，通过在电阻突然降低表示。轻轻向上拉柱塞，以去除多余的空气。
16. 当鼠标演示了足够的双边呼吸频率和深度，响应一个脚趾捏，放置在干净的恢复笼鼠标加热灯下。提供与潮湿的食物和水瓶鼠标，在层流通风橱监测15 - 20分钟。监测夸张的呼吸努力，出血过多，或其他可能危及生命的并发症。
17. 在接下来的三天，通过在IP管理为0.1mg / mL丁丙诺啡止痛药jection每日两次。日常监控鼠标。

结果

小鼠在手术后28天安乐死，心中的收获和检查。将小鼠麻醉，用50 - 75毫克/千克氯胺酮和5 - 10mg / kg的甲苯噻嗪。当动物是足够的麻醉下，胸腔打开，并使用23号针头，冷氯化钾（KCL，30mM的）被注入到心脏的后底下区域。在心脏处于舒张期被捕。对于结扎的进一步验证，心脏从动物取出，被注射4％多聚甲醛，然后1％伊文思蓝染料。 图1显示了在缺血性左心室?...

讨论

随着越来越多地使用在实验室MI模型，所描述的过程旨在提高小鼠的效率和生存率，同时尽量减少他们的手术后疼痛和不适。该协议努力通过使许多改进到LAD结扎过程的各个方面，以尽量减少死亡率。有一些区别。利用氯胺酮和赛拉嗪与异氟醚诱导以来，由于麻醉的持续时间较长的利益有些小鼠气管插管的研究，表明死亡率增加^8。我们的方法只使用异氟烷诱导，大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225