Murine שמאל Anterior יורד (LAD) קשירת עורקים הכליליים: דגם משופר או פשוט עבור אוטם שריר לב

Summary

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Abstract

מחלת לב איסכמית (IHD), או תסמונת כלילית חריפה (ACS), היא אחד הגורמים המובילים למוות בארצות הברית. IHD מאופיין אספקת דם מופחתת אל הלב, וכתוצאה מכך אובדן של חמצן ואת נמק שהתפתח של שריר הלב. מודל MI צבר פופולרי עבור השימוש בו כמודל לטווח קצר איסכמיה-רה-פרפוזיה ומודל קשירה קבעה לטווח ארוך. להלן, אנו מתארים שיטה אמינה עבור קשירת הקבע של LAD. עם טכנולוגיית הנדסה גנטית עכבר הופכת מתקדמת יותר, וכן עם זמינות גוברת של מכשירי ניתוח בעכברי איכות, העכבר הפך מודל פופולרי עבור ניתוחי MI. מודל כירורגיים שלנו משלב את שימוש הרדמה הפיכה בקלות על ההתאוששות המהירה של העכבר; אינטובציה endotracheal פולשנית מבלי לערב שקנה; וכן thoracentesis דרך אתר בית החזה המקורי מבלי ליצור חתך נוסף בחזה, כמונעשה בכמה שיטות אחרות, כדי להסיר עודפי דם ואוויר מן החזה החלל ביעילות. שיטה זו היא יחסית פחות פולשנית מאשר שיטות אחרות, אשר מפחיתות באופן משמעותי סיבוכים כירורגיים לאחר ניתוח ותמותה ומשפרות שחזור.

Introduction

מחלה כלילית, או ACS, הוא אירוע קרדיווסקולארי הנפוץ ביותר ייחשב הגורם העיקרי לתחלואה ולתמותה בעולם 2020 ^1. סיבת ACS היא הנוכחות של פקקת שריר הלב עקב קרע של פלאק טרשתי כלילית שחוסמת או מפחית את זרימת הדם אל הרקמה בלב ^2. לכן, יש קליני סימנים עקביים עם נוכחות של איסכמיה לבבית חריפה, כגון אוטם שריר הלב (MI) ^{3, 4.} MI מובילה לאובדן מסת של שריר הלב ואת התקדמות שיפוץ חדרית פתולוגי, מה שעלול להוביל תפקוד לקוי של החדר ואת אי ספיקת לב ^{5, 6.}

אחת הדרכים היעילות ביותר כדי ללמוד IHD כבר לחקות אוטם שריר לב אנושי במודל חיה. זו מושגת על ידי גורם לחסימה של הבחורעכברים. באמצעות מודל זה, אנחנו לומדים איך הלב יכול להיות מוגן מפני נזק הנובע IHD.

במהלך העשור האחרון, חוקרים השתנו משימוש במודלים של בעלי חיים גדולים יותר לבעלי חיים קטנים, כולל מעבר בין חולדות עכברים. מודל העכבר הקטן מתחיל להיות מועדף מסיבות רבות, כולל גודלם הקטן, בגודל שגר גדול, בעלות נמוכה כדי לשמור, ואת תקופת הריון קצרה, כמו גם לזמינותם המרחיבה של מודלים בנוקאאוט מהונדסים גנטי ^7. למרות העכברים קטנים בגודלם, מכשירי ניתוח חדשים שתוכננו במיוחד עבורם סייעו להתפתחות זו. השיטה שלנו מנצלת מכשירי הניתוח החדשים הללו.

בעוד כמה שיטות ליישם קנה פולשני, אנו משתמשים בשיטה פחות פולשנית של אינטובציה endotracheal. באמצעות תאורה תקורה של הלוע התחתון, אנחנו לצנרר מבלי ליצור שום מקריות, מתן חוויה בטוחה פחות טראומטי עבור tהוא חיה. העכבר ממוקם אז למכונת נשמה והמשיך isoflurane במהלך ההליך כולו. בשל משך ההרדמה הקצר מיוצר על ידי התרופה, זה לוקח רק כמה דקות עבור החיה להתאושש מההרדמה לאחר שהוא הופסק. המודל כירורגי שלנו כולל גם thoracentesis פולשנית. ההסרה הזהירה של דם ואוויר עודף מחלל החזה באמצעות thoracentesis דרך חתך פתיחת בית החזה המקורי התייחסה סיבוך לאחר ניתוח נפוץ של קשירת LAD: את pneumothorax המתח. שיטה זו, אשר מבטלת את הצורך בשני החתכים נוספים המשמשים שיטות-אחד אחרות עבור הניתוח בקנה הנשימה נוסף thoracentesis-הניב פחות סיבוכים לאחר ניתוח פחית תמותה באופן דרסטי.

Protocol

פרוטוקול חיה זו נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדי השתמש (IACUC) בבית חולי רוד איילנד.

הרדמה אינטובציה 1.

1. לשקול את העכבר כדי לחשב את המינון של משככי כאבים שלאחר ניתוח.
2. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה ולספק isoflurane 4% עבור 9 - 10 דק ', ניטור החיה לאורך. הפעל מעקר חרוז חם כך המנגנון יכול מחמם כ 250 מעלות צלזיוס. Preheating ייקח 15 - 20 דקות.
3. לאחר העכבר מגיע מטוס עמוק של הרדמה, עם קצב נשימה של כ 32 נשימות / דקה, למקם את פרקדן העכבר על לוח הקלקר להשתמש גומייה המאובטחת תחת החותכות העליונות להחזיק את הפה פתוח. אשר סדציה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן. מקם פנס בעצמה גבוהה מעל העכבר, כך שניתן יהיה לנגד עיניו את הלוע התחתון.
4. שימוש במלקחיים מעוקלים כדי לפתוח את הלסת ועוד זוג מלקחיים כדי להרים את לשון מהדרך. הקפד לצנרר בעוד התמקמו בבית או מעט מתחת לגובה העיניים עם הגוף של העכבר. השימוש כירורגיים כירורגים מומלצים.
5. דמיינו את הפתיחה והסגירה של מיתרי הקול. כאשר פתוח, הכנס קטטר 20-מד, 1-ב תוך ורידים (IV) עם היכרויות מחט קהה קצה. השתמש במחט כדי להנחות את הקטטר לפתיחת קנה הנשימה, אך להימנע החדרת המחט לתוך קנה הנשימה. אימות למיקום נכון ניתן לעשות זאת באמצעות פיפטה העברת פלסטיק.
6. העבר את העכבר מחובר לצינורות אל משטח הפעלה מצויד מכשיר חימום. חברו את העכבר כדי מאוורר מכרסם קטן מוגדר נפח הפעימה של 150 μL / שבץ שיעור השבץ של 130 משיכות / min.
7. 2.5% לספק isoflurane. בדוק את אינטובציה על ידי בדיקת עליית חזה הבילטרליים. ודא הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן. העכבר עשוי להזדקק 5 - 10 דקות במכונת ההנשמה להיות בהרדמה מלאה.

"Jove_title"> 2. הכנת העכבר

1. סרט במורד צינור אינטובציה באתר המקשר בין ההנשמה ואת קטטר IV. סרט במורד הגפיים. מניחים טיפות סיכה סטרילי על העיניים.
2. חתוך בצד שמאל הגחון של בית החזה עם סכין גילוח חשמלי. אבק הפרווה המגולחת עם מגבונים יבשים למרוח שכבה קטנה של קרם להסרת שיער באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי. הקרם צריך להישאר במגע עם זקיקי השיער למשך כ 30 - 45 s.
3. בעוד תהליכים שמנת, למקם שלושה צמר גפן סטרילי בשלושה צינורות 1.5 מ"ל מלאים בבטאדין לספוג. באמצעות מגבונים טבולים במים מזוקקים, בעדינות לנגב את השמנת פרווה.
4. נקה את שדה הניתוח שלוש פעמים, לסירוגין בבטאדין רפידות הכנה isopropanol 70% סטרילי, ניקוי בתנועה מעגלית נע ממרכז אל הפריפריה. מניחים וילון סטרילי עם חור בגודל רבע מעל השדה כירורגית של העכבר.
5. נקו את האזור שסביב mousדואר עם אתנול 70%. ודא הרדמה פעם נוספת עם קמצוץ הבוהן.

3. LAD קשירה

1. מניחים את מכשירי ניתוח autoclaved ב מעקר את החרוז חם שחומם מראש ל 250 מעלות צלזיוס למשך כ 20 שניות. מניחים את כלי מעוקר על לעטוף כירורגית autoclaved סטרילי. דון כפפות מנתחים.
2. השתמשו עדין קצה מלקחיים כדי להסיר את העור בעדינות בנקודה כ 5 מ"מ בצד שמאל של סחוס xiphoid בולט. השתמש אזמל כירורגי עם להב מס '10 כדי ליצור חתך אנכי בעור מנקודה זו כלפי מעלה, לרמה של manubrium.
3. שימוש במלקחיים מעוקל בעדינות כדי להפריד את שכבות העור והשרירים. פתח את שכבת השריר, בעקבות החתך בעור. הכניסו שתי 5-0 תפרים פוליפרופילן דרך שכבת השריר, אחד בכל צד של החתך, ולאבטח את התפרים זמנית עם מלחציים כדי להחזיק את שכבת השריר פתוח.
4. זהה ולעשות חתך בחלל צלעי השלישי, בעקבותזווית טבעית של בית החזה. הסר את הסרט מן בגפיים השמאליים של העכבר ולאבטח הרגל האחורית השמאלית שלה ברגל הימנית האחורית שלו עם קלטת. חותכים חתיכה ארוכה של קלטת ולאבטח הרגל הקדמית השמאלית שלו אל פני השטח ההפעלה במצב מוגבה מעט. נקה את הכפפות עם אתנול 70%.
5. השתמש מפשק להפיץ בעדינות לגזרים את צלעות 3 ^rd ו 4 ^th. חותכים מקטע קטן של גזה סטרילי, כ 1 ב x ½ ב, לטבול אותו מלוחים 0.9% סטרילי. סוחט את מלוחים העודפים להשתמש במלקחיים כדי להכניס את הגזה בעדינות כנגד הריאה השמאלית כדי למנוע ניזק ריאות בשוגג במהלך ההליך.
6. הוצא בעדינות את קרום הלב הדק עם מלקחיים.
7. קורע כמות קטנה של צמר גפן את מקלון צמר גפן סטרילי לגלגל אותו לכדור קטן. טובלי צמר גפן זה לתוך מלוח 0.9% סטרילי ספוגי בעדינות על פני השטח של הלב כדי להעריך את העורקים. דחף בעדינות את החדר השמאלי כלפי מעלה לאתר את העורקים הכליליים תחתneath.
8. זהה את LAD ולהעביר תפר ניילון 8-0 תחת LAD; שלם שני זורק כדי לאבטח את הקשירה. אם הקשירה היא מוצלחת, דיסטלי החדר השמאלי מן לחלוט הרצון ליגטורה.
9. בעזרת מלקחיים, להסיר את הגזה הוכנסה קודם לכן, ולאחר מכן להסיר בעדינות המפשקת. מחדיר צינורית גמישה 6-ב, 25-מד מצורף מחט 25-מד לתוך חלל בית החזה דרך פתח פתיחת בית החזה. Advance כ 1 - 2 ב של צינור לתוך החלל מעל הריאה השמאלית. החזר את עכבר פרקדן ולנקות את הכפפות עם אתנול 70%.
10. השתמשו 5-0 תפרים פוליפרופילן בדפוס נקטע פשוט לסגור את בית החזה, שמירה על צינור החזה במקום. הסר את שני תפרים מחזיקים את שכבת השריר פתוחה. השתמשו 5-0 תפרים פוליפרופילן ב דפוס מתמשך פשוט לסגור את שכבת השריר, שוב שמירה על צינור החזה במקום.
11. צרף מזרק 1 מ"ל על מחט 25-מד על צינור החזה. משוך בעדינות כלפי מעלה על הצעדr בעוד בהדרגה במקביל לחילוץ צינור חזה מחלל החזה עם מלקחיים. חלץ את הצינורות לאט, כמו צעד זה מסיר אוויר ודם עודפים, שאחרת להיות לכוד בתוך חלל החזה ולגרום pneumothorax.
12. לאחר המזרק מלא, לנתק את המזרק מהמחט ולהיפטר מהפסולת בכוס או כיור פסולת. המשך תהליך זה עד צינור החזה מופק לחלוטין. ודא כי החזה הוא אטום היטב.
13. החלש את isoflurane ל 1.5%. סגור את העור עם 4-0 תפרי פוליפרופילן בדפוס נקטע פשוט. סובב את מאדה isoflurane off.
14. נהל 0.1 מ"ג / מ"ל ​​עצירות מלוחים 0.9% באמצעות זריקה intraperitoneal (IP). טופיקלי חלים 2 מ"ג / מ"ל ​​לידוקאין עם 2 מ"ג / מ"ל ​​Bupivacaine מלוחים 0.9% ל החתך. נהל בין 200 - 500 μL של מלוחים 0.9% באמצעות זריקה תת עורית, ומדרוג הסכום המלוח למשקל של העכבר.
15. המתן 5 דקות לאחר adminiואחסון התרופות לשיכוך כאבים כדי להסיר את העכבר מהצינור אינטובציה. זה מסייע במעבר ממכונת ההנשמה.
    1. אם העכבר לא קיים עליית חזה הבילטרליים פעם ממכונת ההנשמה, לבצע דקומפרסיה מחט. כדי לעשות זאת, להציג את מחט סטרילית 25-מד ומזרק 1-מ"ל בין צלעות 3 ^rd ו 4 ^th עד שהוא נכנס חלל בית החזה, כונה על ידי ירידה פתאומית התנגדות. משוך כלפי מעלה בעדינות על הבוכנה כדי להסיר אוויר עודף.
16. כאשר העכבר מדגים שיעור נשימת הבילטרליים נאות ועומק ומגיב קמצוץ בוהן, למקם את העכבר בכלוב התאוששות נקי מתחת לפנס חום. ספק את העכבר עם מזון לח ובקבוק מים, ניטור במנדף זרימה למינרית במשך 15 - 20 דקות. נטר עבור במאמץ נשימה מוגזם, דימום יתר, או סיבוכים פוטנציאליים אחרים מסכני חיים.
17. במשך שלושת הימים הבאים, לנהל תרופה 0.1 מ"ג / מ"ל ​​עצירות כאבים דרך כתובת IP בjection פעמיים ביום. צג את העכבר יומי.

תוצאות

העכברים מומתים עשרים ושמונה ימים לאחר הניתוח, ואת הלבבות נקצרים ובחן. העכברים מורדמים עם 50 - 75 מ"ג / ק"ג קטמין ו 5 - 10 מ"ג / ק"ג xylazine. כאשר החיה נמצאת תחת הרדמה נאותה, חלל בית החזה נפתח, באמצעות מחט 23-מד, אשלגן כלורי קר (KCL, 30 מ"מ) מוזרק באזור הבסיס...

Discussion

עם שימוש גובר של מודל MI במעבדות, ההליך המתואר הוא שואף להגדיל את שיעור יעילות הישרדות של העכברים תוך מזעור שלאחר ניתוח הכאבים ואי הנוחות שלהם. פרוטוקול זה שואף למזער תמותה על ידי ביצוע שיפורים רבים להיבטים שונים של הליך קשירת LAD. ישנן כמה הבחנות. מספר מחקרים ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225