Murino Descendente Anterior Esquerda (LAD) ligação da artéria coronária: um modelo melhorado e simplificado para Infarto do Miocárdio

Resumo

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Resumo

doença isquêmica do coração (DIC), ou síndrome coronariana aguda (SCA), é uma das principais causas de morte nos Estados Unidos. DIC é caracterizada por fornecimento reduzido de sangue ao coração, resultando na perda de oxigénio a que se seguiu e a necrose do músculo cardíaco. O modelo MI ganhou popularidade por seu uso como modelo de isquemia-reperfusão de curto prazo e um modelo de ligadura permanente de longo prazo. A seguir, descrevemos um método confiável para a ligadura permanente da LAD. Com rato tecnologia de engenharia genética cada vez mais avançadas, e com uma crescente disponibilidade de instrumentos cirúrgicos murino de qualidade, o rato tornou-se um modelo popular para cirurgias MI. Nosso modelo cirúrgico incorpora o uso de um anestésico facilmente reversível para a rápida recuperação do mouse; uma intubação endotraqueal minimamente invasivo, sem envolver uma traqueostomia; e uma thoracentesis através do site toracotomia original, sem a criação de uma incisão adicional no peito, como éfeito em alguns outros métodos, para remover eficazmente o excesso de sangue e ar a partir da cavidade torácica. Este método é relativamente menos invasivos do que outros métodos, o que reduz dramaticamente complicações e mortalidade cirúrgica e de pós-cirúrgicas e melhora a reprodutibilidade.

Introdução

Doença coronária, ou ACS, é o evento cardiovascular mais prevalente e será considerada a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo em 2020 ^1. A causa de ACS é a presença de uma trombose do miocárdio devido à ruptura de uma placa aterosclerótica coronária que bloqueia ou reduz o fluxo de sangue para o tecido do coração ^2. Portanto, há sinais clínicos consistentes com a presença de isquémia miocárdica aguda, tais como o enfarte do miocárdio (MI) ^{de 3, 4.} MI leva a uma perda de massa dos cardiomiócitos e uma progressão para o remodelamento ventricular patológica, o que pode levar à disfunção ventricular e insuficiência cardíaca ^{5, 6.}

Uma das formas mais eficazes para estudar DIC tem sido a de imitar a enfarte do miocárdio humano num modelo animal. Isto é conseguido por oclusão da LAD emratos. Usando esse modelo, estudamos como o coração pode ser protegido contra os danos resultantes de DIC.

Durante a última década, os pesquisadores mudaram de utilizar modelos animais maiores para pequenos animais, incluindo a mudança de ratos para camundongos. O modelo mais pequeno rato está começando a ser preferido por muitas razões, incluindo o seu tamanho pequeno, tamanho grande maca, baixo custo de manutenção, e de curto período de gestação, assim como para a disponibilidade expansiva de transgénicos e knockout do gene modelos ^7. Embora os ratos são pequenos em tamanho, os novos instrumentos cirúrgicos projetado especificamente para eles ter ajudado neste desenvolvimento. Nosso método utiliza estes novos instrumentos cirúrgicos.

Embora vários métodos de implementação de uma traqueotomia invasivo, usamos um método menos invasivo da intubação endotraqueal. Usando iluminação sobrecarga da orofaringe, que entubar sem criar nenhuma incisão, proporcionando uma experiência mais segura e menos traumática para tEle animal. O rato é em seguida colocado num ventilador e mantido em isoflurano durante todo o procedimento. Devido à curta duração da anestesia produzidos pela droga, demora apenas alguns minutos para que o animal recuperar da anestesia, uma vez que é descontinuada. Nosso modelo cirúrgico inclui também um thoracentesis minimamente invasiva. A remoção cuidadosa do sangue e excesso de ar a partir da cavidade torácica Toracocentese através da incisão inicial toracotomia abordou uma complicação pós-operatória comum da ligadura LAD: a tensão pneumotórax. Este método, o qual elimina a necessidade das duas incisões adicionais utilizados noutros métodos de-um para o outro para traqueostomia e o menor número de complicações pós-cirúrgicas toracentese-rendeu e reduziu drasticamente a mortalidade.

Protocolo

Este protocolo animal foi analisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) no Hospital Rhode Island.

1. A anestesia e intubação

1. Pesa-se o rato para calcular a dosagem de medicação para a dor pós-operatória.
2. Colocar o rato numa câmara de indução e entregar 4% de isoflurano para 9-10 min, monitorizando o animal ao longo. Ligar um esterilizador quente talão de modo que o aparelho pode pré-aquecer a aproximadamente 250 ° C. O pré-aquecimento levará 15 - 20 min.
3. Uma vez que o rato atinge um plano de profundidade de anestesia, a respiração com uma taxa de cerca de 32 respirações / min, colocar o rato supina sobre uma placa de Styrofoam e usar uma banda elástica fixada sob os incisivos superiores para segurar a boca aberta. Confirmar sedação através da realização de uma pitada dedo do pé. Posicionar um iluminador de alta intensidade acima do rato de modo que a orofaringe pode ser visualizado.
4. Use uma pinça curva para abrir a garra e outro parde fórceps para erguer a língua para fora do caminho. Certifique-se de entubar enquanto posicionado no ou ligeiramente abaixo do nível dos olhos com o corpo do mouse. O uso de lupas cirúrgicas é recomendado.
5. Visualize a abertura e fechamento das cordas vocais. Quando abertas, inserir um calibre 20, 1-na (IV) de cateter intravenoso com um introdutor de agulha de ponta romba. Usar a agulha para guiar o cateter para a abertura da traqueia, mas evitar a inserção da agulha para dentro da traqueia. Verificação do posicionamento correto pode ser feito usando uma pipeta de plástico.
6. Transferir o rato entubados para uma superfície operacional equipado com um dispositivo de aquecimento. Ligue o rato a um pequeno ventilador de roedor definido como um volume de curso de 150 uL / ​​acidente vascular cerebral e uma taxa de acidente vascular cerebral de 130 cursos / min.
7. Fornecer 2,5% de isoflurano. Verifique a intubação, marcando a expansão do tórax bilateral. Verifique anestesia através da realização de uma pitada dedo do pé. O rato pode precisar de 5 - 10 min sobre o ventilador para se tornar totalmente anestesiado.

2. Preparando o mouse

1. Fita para baixo do tubo de intubação no local de ligação entre o ventilador e o cateter IV. Tape as extremidades. Coloque gotas lubrificantes estéreis sobre os olhos.
2. Aparar o lado ventral esquerda do tórax com uma máquina de barbear eléctrica. Poeira da pele rapada com toalhetes secos e aplicar uma pequena camada de creme de depilação usando uma mecha de algodão estéril. O creme deve permanecer em contato com os folículos pilosos para aproximadamente 30 - 45 s.
3. Enquanto os processos de creme, colocar três cotonetes estéreis em três tubos de 1,5 ml, cheio com Betadine para embeber. Usando lenços umedecidos com água destilada, limpe suavemente o creme e pele.
4. Limpar o campo cirúrgico três vezes, alternando Betadine e estéreis de 70% de isopropanol almofadas de preparação, limpeza com um movimento circular em movimento do centro para a periferia. Coloque uma cortina estéril com um buraco do tamanho de um quarto de todo o campo cirúrgico do mouse.
5. Limpar a área em torno do mouse com 70% de etanol. Verifique anestesia mais uma vez com uma pitada dedo do pé.

3. LAD Ligadura

1. Colocar os instrumentos cirúrgicos autoclavada em esterilizador quente talão pré-aquecido a 250 ° C durante aproximadamente 20 s. Coloque os instrumentos esterilizados no campo cirúrgico autoclavado estéril. Don luvas cirúrgicas.
2. Use uma pinça de ponta fina para levantar delicadamente a pele em um ponto aproximadamente 5 mm à esquerda da cartilagem xifóide proeminente. Usar um bisturi cirúrgico com uma lâmina n ° 10 para criar uma incisão vertical na pele a partir deste ponto para cima, para o nível do manubrium.
3. Use uma pinça curva para separar delicadamente as camadas da pele e músculo. Abrir a camada muscular, após a incisão na pele. Inserir dois 5-0 suturas de polipropileno através da camada muscular, uma em cada lado da incisão, e assegurar que as suturas temporariamente com grampos para segurar a camada de músculo aberto.
4. Identificar e fazer uma incisão no terceiro espaço intercostal, seguindo oângulo natural da caixa torácica. Retire a fita a partir das extremidades esquerdo do mouse e garantir o seu pé traseiro esquerdo para seu pé direito traseiro com fita adesiva. Cortar um pedaço maior de fita e assegurar o seu pé frontal esquerda para a superfície operacional numa posição ligeiramente elevada. Limpe as luvas com 70% de etanol.
5. Utilize um afastador para espalhar delicadamente para além dos 3 ^º e 4 ^º costelas. Cortar uma pequena secção de gaze estéril, aproximadamente 1 em x ½ em, e mergulhá-lo em solução salina estéril a 0,9%. Espremer para fora o excesso de soro fisiológico e utilizar uma pinça para inserir suavemente a gaze contra o pulmão esquerdo para prevenir danos nos pulmões acidental durante o procedimento.
6. Suavemente remover o pericárdio fina com uma pinça.
7. Rasgar uma pequena quantidade de algodão off um cotonete estéril e enrolá-lo em uma pequena bola. Mergulhar esta bola de algodão em solução salina estéril a 0,9% e limpe suavemente sobre a superfície do coração para apreciar as artérias. Suavemente empurrar a aurícula esquerda para cima e para localizar as artérias coronárias sobNeath.
8. Identificar o LAD e passar um fio de sutura 8-0 de nylon sob a LAD; completa dois lances para garantir a ligadura. Se a ligação for bem sucedida, o ventrículo esquerdo distai do branquear vontade ligadura.
9. Utilizando uma pinça, retire a gaze inserido anteriormente, e em seguida, remover suavemente o afastador. Inserir uma 6-in, de calibre 25 de tubo flexível ligada a uma agulha de calibre 25 para dentro da cavidade torácica, através da abertura de toracotomia. Avançar aproximadamente 1 - 2 em de tubagem para dentro do espaço acima do pulmão esquerdo. Devolver o mouse para a posição supina e limpar as luvas com 70% de etanol.
10. Use 5-0 de polipropileno em um padrão simples interrompido para fechar a caixa torácica, mantendo o tubo no peito no lugar. Retire as duas suturas segurando a camada muscular aberto. Use 5-0 suturas de polipropileno em um padrão contínuo simples para fechar a camada muscular, novamente mantendo o tubo de peito no lugar.
11. Anexar uma seringa de 1 mL para a agulha de calibre 25 na tubo de peito. Com cuidado, puxe para cima na mergulharr ao extrair simultaneamente gradualmente o tubo de peito da cavidade torácica com uma pinça. Extrai-se a tubagem lentamente, como este passo remove o excesso de ar e sangue, que de outro modo ficam presas na cavidade torácica e em resultado um pneumotórax.
12. Uma vez que a seringa é cheia, retirar a seringa da agulha e eliminar os resíduos numa proveta ou dissipador de resíduos. Continuar o processo até que o tubo de peito é completamente extraído. Certifique-se que o peito é hermeticamente fechado.
13. Diminuir o isoflurano a 1,5%. Feche a pele com 4-0 de polipropileno em um padrão simples interrompido. Ligue o vaporizador isoflurano off.
14. Administrar 0,1 mg / ml de buprenorfina em 0,9% de soro fisiológico por meio de uma injecção intraperitoneal (IP). Topicamente aplicáveis ​​2 mg / ml de lidocaína com 2 mg / ml em Bupivacaína 0,9% de solução salina para a incisão. Administrar entre 200-500? L de 0,9% de soro fisiológico por meio de uma injecção subcutânea, o dimensionamento da quantidade de solução salina para o peso do rato.
15. Esperar 5 min após a administering os medicamentos para a dor para remover o rato a partir do tubo de intubação. Isto ajuda na transição do respirador.
    1. Se o mouse não tem uma elevação do tórax bilateral uma vez fora do ventilador, realizar descompressão agulha. Para o fazer, introduzir uma agulha estéril de calibre 25 e uma seringa de 1 mL entre os dias ³ e 4 ^th costelas até que ele entra na cavidade torácica, denotada por uma diminuição súbita na resistência. Puxe suavemente o êmbolo para remover o excesso de ar.
16. Quando o rato demonstra uma taxa de respiração bilateral adequada e profundidade e responde a uma pitada dedo do pé, coloque o rato em uma gaiola de recuperação limpa sob uma lâmpada de calor. Fornecer o rato com alimentos húmidos e uma garrafa de água, a monitorização em uma câmara de fluxo laminar para 15 - 20 min. Monitor para um esforço exagerado para respirar, sangramento excessivo, ou outras complicações potencialmente fatais.
17. Durante os próximos três dias, administrar 0,1 mg / ml de buprenorfina medicação para a dor por meio de um IPprojeç~ao duas vezes por dia. Monitorar o mouse diária.

Resultados

Os ratinhos são sacrificados vinte e oito dias após a cirurgia, e os corações são colhidas e examinadas. Os ratos são anestesiados com 50-75 mg / kg de cetamina e 5 - 10 mg / kg de xilazina. Quando o animal está sob anestesia adequada, a cavidade torácica é aberta, e utilizando uma agulha de calibre 23, cloreto de potássio frio (KCL, 30 mM) é injectado na região posterior da basal do coração. O coração é preso em diástole. Para mais a validação da ligadura, o coraçã...

Discussão

Com uma crescente utilização do modelo MI em laboratórios, o procedimento descrito visa aumentar a taxa de eficiência e de sobrevivência dos ratos, minimizando a dor pós-operatória e desconforto. Este protocolo se esforça para minimizar a mortalidade, fazendo inúmeras melhorias para vários aspectos do procedimento LAD ligadura. Existem algumas distinções. Alguns estudos de intubação murino que utilizam cetamina e xilazina, juntamente com isoflurano para a indução, devido ao benefício de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225