Murino discendente anteriore sinistra (LAD) Coronary legatura dell'arteria: una migliore e semplificata del modello di infarto miocardico

Riepilogo

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Abstract

cardiopatia ischemica (IHD), o sindrome coronarica acuta (ACS), è una delle principali cause di morte negli Stati Uniti. IHD è caratterizzata da un ridotto apporto di sangue al cuore, con conseguente perdita di ossigeno e la necrosi conseguente del muscolo cardiaco. Il modello MI ha guadagnato popolarità per il suo uso come un modello di ischemia-riperfusione a breve termine e un modello di legatura permanente a lungo termine. Qui di seguito, si descrive un metodo affidabile per la legatura permanente della LAD. Con il mouse tecnologia di ingegneria genetica sempre più avanzati, e con una crescente disponibilità di strumenti chirurgici murini di qualità, il mouse è diventato un modello popolare per interventi chirurgici MI. Il nostro modello chirurgico incorpora l'uso di un anestetico facilmente reversibile per il rapido recupero del mouse; un'intubazione endotracheale minimamente invasivo senza coinvolgere una tracheotomia; ed una toracentesi attraverso il sito toracotomia originale senza creare un'incisione supplementare nel petto, come èfatto in alcuni altri metodi, per rimuovere efficacemente sangue in eccesso e l'aria dalla cavità toracica. Questo metodo è relativamente meno invasivo rispetto ad altri metodi, che riduce drasticamente le complicanze e mortalità chirurgiche e post-chirurgiche e migliora la riproducibilità.

Introduzione

Malattia coronarica, o di ACS, è l'evento cardiovascolare più diffusa e sarà considerato la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo nel 2020 ^1. La causa di ACS è la presenza di una trombosi infarto a causa della rottura di una placca aterosclerotica coronarica che blocca o riduce il flusso di sangue al tessuto cardiaco ^2. Pertanto, ci sono segni clinici compatibili con la presenza di ischemia miocardica acuta, come infarto del miocardio (MI) ^{3, 4.} MI porta ad una perdita di massa dei cardiomiociti e una progressione di rimodellamento ventricolare patologica, che può portare alla disfunzione ventricolare e di insufficienza cardiaca ^{5, 6.}

Uno dei modi più efficaci per lo studio IHD è stato quello di imitare l'infarto del miocardio umano in un modello animale. Ciò si ottiene occludendo il LAD intopi. Utilizzando questo modello, studiamo come il cuore può essere protetto dai danni derivanti da IHD.

Negli ultimi dieci anni, i ricercatori hanno spostato da utilizzando modelli animali più grandi per gli animali più piccoli, tra cui il passaggio da ratti ai topi. Il modello di topo più piccola sta cominciando a essere preferito per molte ragioni, tra le loro piccole dimensioni, di grandi dimensioni lettiera, a basso costo per mantenere, e di breve periodo di gestazione, nonché per la disponibilità espansiva di transgenici e knockout gene modelli ^7. Anche se i topi sono di piccole dimensioni, nuovi strumenti chirurgici appositamente pensate per loro hanno aiutato in questo sviluppo. Il nostro metodo utilizza questi nuovi strumenti chirurgici.

Mentre diversi metodi implementano una tracheotomia invasivo, usiamo un metodo meno invasivo di intubazione endotracheale. Utilizzando illuminazione zenitale dell'orofaringe, abbiamo intubare senza creare incisioni, fornendo un'esperienza più sicuro e meno traumatico per tegli animali. Il mouse viene poi posto su un ventilatore e continuò a isoflurano durante l'intera procedura. A causa della breve durata dell'anestesia prodotta dalla droga, ci vogliono solo pochi minuti per consentire all'animale di riprendersi dall'anestesia una volta che è interrotto. Il nostro modello chirurgico include anche una toracentesi minimamente invasiva. La facilità di rimozione del sangue e aria in eccesso dalla cavità toracica utilizzando toracentesi attraverso l'incisione toracotomia originale ha inviato una complicanza postoperatoria comune dei legatura LAD: il pneumotorace. Questo metodo, che elimina la necessità per le due incisioni supplementari usati in altri metodi, uno per la tracheotomia e un altro per le toracentesi-ha prodotto un minor numero di complicanze post-chirurgiche e ha drasticamente ridotto la mortalità.

Protocollo

Questo protocollo animale è stato esaminato e approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) a Rhode Island Hospital.

1. Anestesia e intubazione

1. Pesare il mouse per calcolare il dosaggio del farmaco dolore post-operatorio.
2. Posizionare il mouse in una camera di induzione e fornire 4% isoflurano per 9-10 min, monitorando l'animale in tutto. Attivare uno sterilizzatore a caldo tallone in modo che il dispositivo può preriscaldare a circa 250 ° C. Il preriscaldamento si 15 - 20 min.
3. Una volta che il mouse raggiunge un profondo piano di anestesia, con un tasso di respirazione di circa 32 respiri / min, posizionare il topo supina su un bordo polistirolo e utilizzare un elastico fissato sotto all'inizio incisivi per tenere la bocca aperta. Confermare la sedazione eseguendo un pizzico dito del piede. Posizionare un illuminatore ad alta intensità sopra il mouse in modo che l'orofaringe può essere visualizzato.
4. Utilizzare pinze curve per aprire la mascella e un'altra coppiadi pinze per sollevare la linguetta fuori strada. Assicurati di intubare mentre posizionata in corrispondenza o leggermente al di sotto degli occhi a livello con il corpo del mouse. Si raccomanda l'uso di occhialini chirurgici.
5. Visualizza l'apertura e la chiusura delle corde vocali. Quando aperto, inserire un calibro 20, 1-a endovenosa (IV) catetere con un ago introduttore smussato-punta. Utilizzare l'ago per guidare il catetere per l'apertura tracheale, ma evitare di inserire l'ago nella trachea. Verifica del corretto posizionamento può essere fatto utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica.
6. Trasferire il mouse intubato ad una superficie operativo dotato di un dispositivo di riscaldamento. Collegare il mouse per un piccolo ventilatore roditore impostato su un volume di eiezione di 150 microlitri / ictus e una frequenza corsa di 130 colpi / min.
7. Consegnare 2,5% isoflurano. Verificare l'intubazione controllando per sollevamento del torace bilaterale. Verificare anestesia eseguendo un pizzico punta. Il mouse può avere bisogno di 5 - 10 minuti sul ventilatore per diventare pienamente anestetizzati.

2. Preparazione del mouse

1. Nastro lungo il tubo di intubazione nel sito di collegamento tra il ventilatore e il catetere IV. Tape le estremità. Mettere gocce lubrificanti sterili sugli occhi.
2. Tagliare la parte ventrale sinistro del torace con un rasoio elettrico. Rispolverare il pelo rasato con panni asciutti e applicare un piccolo strato di crema depilatoria usando un tampone di cotone sterile. La crema deve rimanere in contatto con i follicoli dei capelli per circa 30 - 45 s.
3. Mentre i processi crema, posizionare tre tamponi di cotone sterile in tre provette da 1,5 mL riempito con Betadine ammollo. Utilizzando salviette inumidite con acqua distillata, delicatamente spazzare via la panna e pelliccia.
4. Pulire il campo chirurgico tre volte, alternando Betadine e sterili 70% pastiglie isopropanolo preparazione, pulizia in un movimento circolare dal centro alla periferia. Posizionare un telo sterile con un foro quarto imprese sopra il campo operatorio del mouse.
5. Pulire la zona circostante il mouse con il 70% di etanolo. Verificare l'anestesia ancora una volta con un pizzico dito del piede.

3. LAD legatura

1. Posizionare gli strumenti chirurgici sterilizzati in autoclave a caldo sterilizzatore tallone preriscaldato a 250 ° C per circa 20 s. Posizionare gli strumenti sterilizzati in autoclave sterile telo chirurgico. Munirsi di guanti chirurgici.
2. Utilizzare pinze fine-tip per sollevare delicatamente la pelle in un punto a circa 5 mm a sinistra della cartilagine xifoide prominente. Utilizzare un bisturi chirurgico con una lama n ° 10 per creare un'incisione verticale nella pelle da questo punto in alto, al livello del manubrio.
3. Utilizzare pinze curve per separare delicatamente gli strati della pelle e dei muscoli. Aprire lo strato muscolare, dopo l'incisione cutanea. Inserire due 5-0 suture in polipropilene attraverso lo strato muscolare, uno su ciascun lato dell'incisione, e fissare i punti di sutura temporaneamente con morsetti per tenere lo strato muscolare aperta.
4. Identificare e fare un'incisione nel terzo spazio intercostale, a seguito dellaAngolo naturale della gabbia toracica. Rimuovere il nastro dalle estremità sinistro del mouse e fissare il piede posteriore sinistro al suo piede posteriore destra con del nastro adesivo. Tagliare un pezzo di nastro più lungo e fissare il piede anteriore sinistro alla superficie operativa in una posizione leggermente elevata. Pulire i guanti con il 70% di etanolo.
5. Utilizzare un riavvolgitore per diffondere delicatamente a parte i 3 ^° e 4 ^° costole. Tagliare una piccola sezione di garza sterile, circa 1 x ½, ed immergerlo in soluzione fisiologica 0,9% sterile. Spremere il eccesso salina e utilizzare pinze per inserire delicatamente la garza contro polmone sinistro per evitare danni ai polmoni accidentali durante la procedura.
6. Rimuovere delicatamente il pericardio sottile con una pinza.
7. Strappare una piccola quantità di cotone fuori un tampone di cotone sterile e rotolare in una piccola sfera. Immergere il batuffolo di cotone sterile in soluzione fisiologica 0,9% e tamponare delicatamente sulla superficie del cuore di apprezzare le arterie. Spingere delicatamente il padiglione auricolare sinistro verso l'alto e individuare le arterie coronarie sottoNeath.
8. Identificare il LAD e passare una sutura 8-0 nylon sotto il LAD; completa due tiri per fissare la legatura. Se la legatura è successo, il ventricolo sinistro distale dalla volontà Blanch legatura.
9. Utilizzando pinze, rimuovere la garza inseriti in precedenza, e quindi rimuovere delicatamente il divaricatore. Inserire un 6-a, 25-gauge tubo flessibile collegato a un ago calibro 25 nella cavità toracica attraverso l'apertura toracotomia. Anticipo di circa 1 - 2 in di tubo nello spazio sopra il polmone sinistro. Ritorna il mouse in una posizione supina e pulire i guanti con il 70% di etanolo.
10. Utilizzare 5-0 suture polipropilene in un semplice schema interrotto per chiudere la cassa toracica, mantenendo il tubo toracico in posizione. Rimuovere i due punti di sutura che tengono lo strato muscolare aperta. Utilizzare 5-0 punti di sutura in polipropilene in un semplice modello continuo di chiudere lo strato muscolare, mantenendo ancora una volta il tubo toracico al suo posto.
11. Attaccare una siringa da 1 ml al ago calibro 25 sul tubo toracico. Tirare delicatamente verso l'alto il grande passor contemporaneamente gradualmente estrarre il tubo toracico dalla cavità toracica con una pinza. Estrarre il tubo lentamente, come questo passaggio rimuove l'aria in eccesso e sangue, che altrimenti intrappolata nella cavità toracica e risultato in una pneumotorace.
12. Una volta che la siringa è pieno, staccare la siringa dal ago e smaltire i rifiuti in un bicchiere rifiuti o lavandino. Continuare questa procedura finché il tubo toracico è completamente estratto. Assicurarsi che il torace è chiuso.
13. Diminuire l'isoflurano al 1,5%. Chiudere la pelle con 4-0 punti di sutura in polipropilene in un semplice schema interrotto. Girare il vaporizzatore isoflurano off.
14. Somministrare 0,1 mg di buprenorfina / ml in 0,9% di soluzione salina tramite un'iniezione intraperitoneale (IP). applicare topicamente 2 mg / mL di lidocaina con 2 mg / ml in bupivacaina 0,9% soluzione salina per l'incisione. Somministrare tra i 200 - 500 microlitri di soluzione salina allo 0,9% con un'iniezione sottocutanea, scalando l'importo salina al peso del mouse.
15. Attendere 5 minuti dopo administering i farmaci per il dolore per rimuovere il mouse dal tubo di intubazione. Questo aiuta nella transizione dal ventilatore.
    1. Se il mouse non dispone di un aumento del torace bilaterale volta fuori il ventilatore, eseguire la decompressione ago. Per fare questo, introdurre un ago sterile da 25 gauge e una siringa da 1 ml tra i 3 ^° e 4 ^° costole fino ad entrare nella cavità toracica, indicato con una diminuzione improvvisa della resistenza. Tirare verso l'alto delicatamente lo stantuffo per eliminare l'aria in eccesso.
16. Quando il mouse dimostra un tasso di respirazione bilaterale adeguata e la profondità e risponde ad un pizzico dito del piede, posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulito sotto una lampada di calore. Fornire il mouse con alimento umido e una bottiglia di acqua, controllando in una cappa a flusso laminare per 15 - 20 min. Monitor per uno sforzo esagerato respirazione, sanguinamento eccessivo, o altre complicazioni potenzialmente letali.
17. Per i prossimi tre giorni, somministrare 0,1 mg / ml di dolore buprenorfina farmaco tramite un IPjection due volte al giorno. Monitorare il mouse quotidiano.

Risultati

I topi sono eutanasia ventotto giorni dopo l'intervento, e il cuore vengono raccolti ed esaminati. I topi vengono anestetizzati con il 50 - 75 mg / kg di ketamina e 5 - 10 mg / kg xilazina. Quando l'animale è sotto anestesia adeguata, la cavità toracica viene aperto, e utilizzando un ago 23-gauge, cloruro di potassio freddo (KCl, 30 mM) viene iniettata nella regione basale posteriore del cuore. Il cuore è arrestato in diastole. Per ulteriore convalida della ligazione, il cuore...

Discussione

Con un uso crescente del modello MI nei laboratori, la procedura descritta mira ad aumentare il tasso di efficienza e la sopravvivenza dei topi, riducendo al minimo il loro dolore post-operatorio e disagio. Questo protocollo è ridurre al minimo la mortalità facendo numerosi miglioramenti a vari aspetti della procedura LAD legatura. Ci sono alcune distinzioni. Alcuni studi di intubazione murini che utilizzano ketamina e xilazina con isoflurano per l'induzione, grazie al vantaggio della loro durata ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225