Murine gauche interventriculaire antérieure (LAD) Coronary Artery Ligature: un modèle amélioré et simplifié pour Myocardial Infarction

Résumé

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Résumé

Cardiopathie ischémique (IHD), ou d'un syndrome coronarien aigu (SCA), est l'une des principales causes de décès aux États-Unis. IHD est caractérisée par un apport sanguin réduit au cœur, entraînant la perte d'oxygène à la nécrose et de suivi du muscle cardiaque. Le modèle MI a gagné en popularité pour son utilisation comme un modèle d'ischémie-reperfusion à court terme et un modèle de ligature permanente à long terme. Ci-dessous, nous décrivons une méthode fiable pour la ligature permanente de la DAL. Grâce à la technologie du génie génétique de la souris devient plus avancé, et avec une disponibilité croissante d'instruments chirurgicaux murins qualité, la souris est devenu un modèle populaire pour les chirurgies MI. Notre modèle chirurgicale comprend l'utilisation d'un anesthésique facilement réversible pour la récupération rapide de la souris; une intubation endotrachéale mini-invasive sans impliquer une trachéotomie; et un thoracentèse sur le site thoracotomie d'origine sans créer une incision supplémentaire dans la poitrine, commefait dans d'autres méthodes, pour éliminer efficacement l'excès de sang et l'air de la cavité thoracique. Cette méthode est relativement moins invasive que les autres méthodes, ce qui réduit considérablement les complications chirurgicales et post-opératoires et la mortalité et améliore la reproductibilité.

Introduction

La maladie coronarienne, ou ACS, est l'événement cardiovasculaire la plus répandue et sera considéré comme la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde en 2020 ^1. La cause de l' ACS est la présence d'une thrombose du myocarde en raison de la rupture d'une plaque d' athérosclérose coronarienne qui bloque ou réduit le flux sanguin vers le tissu cardiaque ^2. Par conséquent, il existe des signes cliniques cohérents avec la présence d' une ischémie myocardique aiguë, tels que l' infarctus du myocarde (MI) ^{3, 4.} MI conduit à une perte de masse des cardiomyocytes et une progression à un remodelage ventriculaire pathologique, ce qui peut conduire à un dysfonctionnement ventriculaire et l' insuffisance cardiaque ^{5, 6.}

L'un des moyens les plus efficaces pour étudier IHD a été d'imiter un infarctus du myocarde humain dans un modèle animal. Ceci est réalisé en bouchant la LADles souris. En utilisant ce modèle, nous étudions comment le coeur peut être protégé contre les dommages résultant de l'IHD.

Au cours de la dernière décennie, les chercheurs se sont déplacés d'utiliser des modèles animaux plus grands pour les petits animaux, y compris le passage de rats à des souris. Le modèle de la souris plus petite commence à être préféré pour de nombreuses raisons, y compris leur petite taille, de grande taille de la portée, à faible coût pour maintenir et courte période de gestation, ainsi que pour la disponibilité large de modèles transgéniques et knock - out de gène ^7. Bien que les souris sont de petite taille, de nouveaux instruments chirurgicaux spécialement conçus pour eux ont contribué à ce développement. Notre méthode utilise ces nouveaux instruments chirurgicaux.

Bien que plusieurs méthodes à mettre en œuvre une trachéotomie invasive, nous utilisons une méthode moins invasive de l'intubation endotrachéale. En utilisant un éclairage au-dessus de l'oropharynx, nous intuber sans créer des incisions, offrant une expérience plus sûre et moins traumatisante pour til animal. La souris est ensuite placé sur un ventilateur et maintenu sur isoflurane pendant toute la procédure. En raison de la courte durée de l'anesthésie produite par le médicament, il ne prend que quelques minutes pour l'animal de récupérer de l'anesthésie une fois qu'il est arrêté. Notre modèle chirurgical comprend également un mini-invasive thoracentèse. L'élimination soigneuse de sang et de l'excès d'air de la cavité de la poitrine à l'aide thoracentèse à travers l'incision de thoracotomie d'origine a envoyé une complication post-opératoire commune de la ligature DAL: le pneumothorax de tension. Cette méthode, ce qui élimine la nécessité pour les deux incisions supplémentaires utilisées dans d'autres méthodes, un pour la trachéotomie et une autre pour les complications thoracentèse-a produit moins de post-chirurgicales et a réduit la mortalité de façon drastique.

Protocole

Ce protocole animal a été examiné et approuvé par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à Rhode Island Hospital.

1. L'anesthésie et l'intubation

1. Peser la souris pour calculer la dose de médicament de la douleur post-opératoire.
2. Placer la souris dans une chambre d'induction et de livrer 4% d'isoflurane pour 9 - 10 min, suivi de l'animal tout au long. Activer un stérilisateur à billes à chaud de sorte que l'appareil peut préchauffer à environ 250 ° C. Préchauffage prendra 15 - 20 min.
3. Une fois que la souris atteint un plan de profondeur de l'anesthésie, avec un taux de respiration d'environ 32 respirations / min, placer le décubitus dorsal de la souris sur une planche de styromousse et utiliser une bande élastique fixée sous le plateau incisives pour maintenir l'embouchure ouverte. Confirmer la sédation en effectuant un pincement de l'orteil. Positionner un dispositif d'éclairage de haute intensité au-dessus de la souris de sorte que l'oropharynx peut être visualisée.
4. Utiliser des pinces incurvées pour ouvrir la mâchoire et une autre pairede pinces pour soulever la langue de la route. Assurez-vous de intuber tout positionné au niveau ou légèrement en dessous du niveau des yeux avec le corps de la souris. L'utilisation de loupes chirurgicales est recommandée.
5. Visualisez l'ouverture et la fermeture des cordes vocales. Lorsqu'il est ouvert, insérer un cathéter de calibre 20, le 1-en intraveineuse (IV) avec un dispositif d'introduction de l'aiguille à pointe émoussée. Utiliser l'aiguille afin de guider le cathéter à l'ouverture de la trachée, mais il faut éviter d'insérer l'aiguille dans la trachée. Vérification de la mise en place correcte peut être effectuée à l'aide d'une pipette de transfert en plastique.
6. Transférer la souris intubés à une surface d'actionnement munie d'un dispositif de chauffage. Connecter la souris à un petit ventilateur de rongeur fixé à un volume de course de 150 ul / course et une fréquence d'impulsions de 130 coups / min.
7. Délivrer 2,5% d'isoflurane. Vérifiez l'intubation en vérifiant la poitrine bilatérale hausse. Vérifier l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil. La souris peut avoir besoin 5 - 10 min sur le ventilateur pour devenir complètement anesthésié.

2. Préparation de la souris

1. Bande vers le bas du tube d'intubation au niveau du site de liaison entre le ventilateur et le cathéter IV. Bande vers le bas les extrémités. Placez des gouttes lubrifiantes stériles sur les yeux.
2. Couper le côté ventral gauche de la poitrine avec un rasoir électrique. Dépoussiérer la fourrure rasée avec des lingettes sèches et appliquer une petite couche de crème d'épilation à l'aide d'un coton-tige stérile. La crème doit rester en contact avec les follicules pileux pour environ 30 - 45 s.
3. Alors que les processus de crème, placez trois tampons de coton stériles dans trois tubes de 1,5 ml remplis avec de la bétadine à tremper. En utilisant des lingettes humidifiées avec de l'eau distillée, essuyez délicatement la crème et de la fourrure.
4. Nettoyer le champ opératoire trois fois, en alternant Betadine et stériles 70% tampons de préparation d'isopropanol, de nettoyage dans un mouvement circulaire en mouvement du centre vers la périphérie. Placez un champ stérile avec un trou quart de taille sur le champ chirurgical de la souris.
5. Nettoyez la zone entourant les protocoles d'ententee avec 70% d'éthanol. Vérifier anesthésie une fois de plus avec un pincement de l'orteil.

3. CONT Ligature

1. Placer les instruments chirurgicaux autoclavées dans stérilisateur à billes chaud préchauffé à 250 ° C pendant environ 20 s. Placez les instruments stérilisés sur champ opératoire stérile autoclavée. Don des gants chirurgicaux.
2. Utilisez une pince fine pointe pour soulever légèrement la peau, à un point situé approximativement 5 mm à la gauche de l'appendice xiphoïde de premier plan. Utiliser un scalpel chirurgical avec une lame n ° 10 pour créer une incision verticale dans la peau de ce point vers le haut, au niveau du manubrium.
3. Utiliser des pinces incurvées pour séparer doucement les couches de peau et de muscle. Ouvrez la couche musculaire, après l'incision de la peau. Insérez deux 5-0 sutures en polypropylène à travers la couche musculaire, un de chaque côté de l'incision, et fixer les sutures temporairement avec des pinces pour maintenir la couche musculaire ouverte.
4. Identifier et faire une incision dans le troisième espace intercostal, suite à laangle naturel de la cage thoracique. Retirez la bande des extrémités gauche de la souris et fixez le pied arrière gauche à son pied arrière droit avec du ruban adhésif. Couper un morceau plus de bande et assurer son pied avant gauche sur la surface de commande dans une position légèrement élevée. Nettoyer les gants avec 70% d'éthanol.
5. Utilisez un rétracteur de se propager doucement à part les nervures 3 ^e et 4 ^e. Couper une petite section de gaze stérile, environ 1 à x ½ dans, et le tremper dans une solution saline stérile à 0,9%. Essorer la solution saline en excès et utiliser des pinces pour insérer délicatement la gaze contre le poumon gauche pour éviter une atteinte des poumons accidentelle au cours de la procédure.
6. Retirez délicatement le péricarde mince avec une pince.
7. Déchirez une petite quantité de coton au large d'un coton-tige stérile et le rouler dans une petite boule. Trempez cette boule de coton dans une solution saline stérile à 0,9% et tamponner doucement sur la surface du cœur pour apprécier les artères. Poussez doucement l'oreillette gauche vers le haut et localiser les artères coronaires sousNeath.
8. Identifier la DAL et passer une suture de nylon 8-0 sous la LAD; complète deux lancers francs pour assurer la ligature. Si la ligature est réussie, l'extrémité distale du ventricule gauche de la volonté Blanch ligatures.
9. En utilisant une pince, retirer la gaze insérée plus tôt, puis retirez délicatement l'écarteur. Insérer un 6-in, tube flexible de calibre 25 fixée à une aiguille de calibre 25 dans la cavité thoracique à travers l'ouverture de thoracotomie. Avance d'environ 1 - 2 dans des tubes dans l'espace au-dessus du poumon gauche. Retour à la souris une position couchée sur le dos et nettoyer les gants avec 70% d'éthanol.
10. Utilisez 5-0 sutures en polypropylène dans un modèle simple interrompu pour fermer la cage thoracique, en gardant le tube thoracique en place. Retirez les deux sutures tenant la couche musculaire ouverte. Utilisez 5-0 sutures en polypropylène dans un motif continu simple pour fermer la couche musculaire, en gardant à nouveau le tube de la poitrine en place.
11. Attacher une seringue de 1 ml à l'aiguille de calibre 25 sur le tube de poitrine. Tirez doucement vers le haut sur le grand sautr tandis que simultanément extraire progressivement le tube thoracique de la cavité de la poitrine avec une pince. Extraire le tube lentement, comme cette étape élimine l'excès d'air et de sang, qui deviendrait autrement piégé dans la cavité thoracique et le résultat dans un pneumothorax.
12. Une fois que la seringue est pleine, retirer la seringue de l'aiguille et l'élimination des déchets dans un bêcher de déchets ou d'évier. Continuez jusqu'à ce que le tube de la poitrine est complètement extrait. Assurez-vous que le coffre est fermé hermétiquement.
13. Diminuer l'isoflurane à 1,5%. Fermez la peau avec des sutures 4-0 en polypropylène dans un modèle simple interrompu. Éteignez le vaporisateur isoflurane.
14. Administrer 0,1 mg / ml de buprénorphine dans une solution saline à 0,9% par l'intermédiaire d'une injection intraperitoneale (IP). appliquer topiquement 2 mg / ml de lidocaïne à 2 mg / ml de bupivacaïne à 0,9% de solution saline à l'incision. Administrer entre 200 - 500 ul de solution saline à 0,9% par l'intermédiaire d'une injection sous-cutanée, mise à l'échelle de la quantité de solution saline pour le poids de la souris.
15. Attendre 5 minutes après l'adminidirection des médicaments contre la douleur pour supprimer la souris à partir du tube d'intubation. Cette aide à la transition hors du ventilateur.
    1. Si la souris ne dispose pas d'une augmentation de la poitrine bilatérale une fois hors du ventilateur, une décompression à l'aiguille. Pour ce faire, introduire une aiguille stérile de calibre 25 et une seringue de 1 ml entre les 3 ^e et 4 ^e nervures jusqu'à ce qu'elle pénètre dans la cavité thoracique, noté une diminution soudaine de la résistance. Tirer doucement sur le piston pour enlever l'excès d'air.
16. Lorsque la souris montre un taux de respiration bilatérale adéquate et la profondeur et répond à un pincement de l'orteil, placez la souris dans une cage de récupération propre sous une lampe chauffante. Fournir la souris avec des aliments humides et une bouteille d'eau, la surveillance dans une hotte à flux laminaire pendant 15 - 20 min. Surveiller un effort de respiration exagérée, des saignements excessifs ou d'autres complications potentiellement mortelles.
17. Pour les trois prochains jours, administrer 0,1 mg / ml médicaments contre la douleur de la buprénorphine via une IPjection deux fois par jour. Surveiller la souris par jour.

Résultats

Les souris sont euthanasiés vingt-huit jours après la chirurgie, et les coeurs sont récoltés et examinés. Les souris sont anesthésiées avec 50 à 75 mg / kg de kétamine et de 5 - 10 mg / kg de xylazine. Lorsque l'animal est sous anesthésie adéquate, la cavité thoracique est ouverte, et en utilisant une aiguille de calibre 23, le chlorure de potassium froid (KCL, 30 mM) est injecté dans la région basale postérieure du cœur. Le cœur est arrêté en diastole. Pour une va...

Discussion

Avec une utilisation croissante du modèle MI dans les laboratoires, la procédure décrite vise à accroître l'efficacité et le taux de survie des souris tout en minimisant leur douleur post-opératoire et l'inconfort. Ce protocole vise à réduire au minimum la mortalité en faisant de nombreuses améliorations à divers aspects de la procédure de ligature de LAD. Il y a quelques distinctions. Certaines études d'intubation murins qui utilisent la kétamine et de xylazine avec isofluran...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225