Murine linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterienligatur: ein verbessertes und vereinfachtes Modell für Myokardinfarkts

Zusammenfassung

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Zusammenfassung

Ischämische Herzkrankheit (IHD) oder akuter Koronarsyndrom (ACS) ist eine der führenden Todesursachen in den Vereinigten Staaten. IHD wird durch reduzierte Blutzufuhr zum Herzen, was den Verlust von Sauerstoff und der anschließenden Nekrose des Herzmuskels gekennzeichnet. Das MI-Modell hat an Popularität gewinnt für seine Verwendung als kurzfristiges Ischämie-Reperfusion-Modell und ein langfristigen Dauer Ligatur-Modell. Im Folgenden beschreiben wir für die dauerhafte Unterbindung der LAD eine zuverlässige Methode. Mit der Maus genetische immer Engineering-Technologie weiter fortgeschritten ist, und mit einer zunehmenden Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Maus-chirurgischen Instrumenten hat die Maus ein beliebtes Modell für MI Operationen worden. Unser OP-Modell beinhaltet die Verwendung eines leicht umkehrbar Anästhetikum für die schnelle Wiederherstellung der Maus; eine minimal-invasive Intubation ohne eine Tracheotomie beteiligt sind; und Thorakozentese durch die ursprüngliche Thorakotomie Seite ohne einen zusätzlichen Einschnitt in der Brust zu schaffen, wiein einigen anderen Verfahren durchgeführt, um effektiv überschüssiges Blut und Luft aus der Brusthöhle entfernt werden. Dieses Verfahren ist vergleichsweise weniger invasiv als andere Methoden, die dramatisch chirurgische und postoperativen Komplikationen und Mortalität und verbessert die Reproduzierbarkeit verringert.

Einleitung

Koronarer Herzkrankheit oder ACS, sind die häufigste kardiovaskulären Ereignisse und die Hauptursache für Morbidität und Mortalität weltweit im Jahr 2020 ¹ in Betracht gezogen werden. Die Ursache des ACS ist das Vorhandensein einer myokardialen Thrombose aufgrund des Bruches eines koronaren atherosklerotischen Plaques , die Blöcke oder den Blutfluss zum Herzgewebe ² reduziert. Daher gibt es klinische Symptome mit dem Vorhandensein von akuter myokardialen Ischämie, wie Myokardinfarkt (MI) ^{3, 4.} MI führt zu einem Verlust in der Masse der Kardiomyozyten und eine Progression zu pathologischen ventrikulären Remodeling, die ^{6 5,} ventrikuläre Dysfunktion und Herzinsuffizienz führen können.

Einer der effektivsten Wege, IHD zu untersuchen wurde in einem Tiermodell menschlicher Myokardinfarkt zu imitieren. Dies wird durch Verschließen des LAD erreichtMäuse. Mit diesem Modell untersuchen wir, wie das Herz aus den von IHD Schäden geschützt werden.

Im letzten Jahrzehnt haben Forscher aus mit größeren Tiermodellen für kleinere Tiere, einschließlich der Verschiebung von Ratten Mäuse verschoben. Je kleines Mausmodell beginnt aus vielen Gründen bevorzugt werden, einschließlich ihrer geringen Größe, große Wurfgröße, niedrig Kosten und kurze Tragezeit sowie für die expansive Verfügbarkeit von transgenen und Gen - Knockout - Modellen ⁷ zu halten. Obwohl Mäuse in der Größe klein sind, neue chirurgische Instrumente speziell für sie haben in dieser Entwicklung unterstützt. Unsere Methode nutzt diese neue chirurgische Instrumente.

Während mehrere Methoden, um eine invasive Tracheotomie zu implementieren, verwenden wir eine weniger invasive Methode zur Intubation. Mit Kopf Beleuchtung des Rachens, intubieren wir ohne Einschnitt zu schaffen, eine sicherere und weniger traumatische Erfahrung für t Bereitstellunger Tier. Die Maus wird dann an einem Beatmungsgerät platziert und gehalten auf Isofluran während des gesamten Verfahrens. Aufgrund der kurzen Dauer der Anästhesie durch das Medikament produziert, es dauert nur ein paar Minuten für das Tier aus der Narkose zu erholen, sobald es abgebrochen wird. Unser OP-Modell enthält auch eine minimalinvasive Pleurapunktion. Die sorgfältige Entfernung von Blut und überschüssiger Luft aus dem Brustraum Thorakozentese durch die ursprüngliche Thorakotomie Inzision verwendet, hat eine gemeinsame postoperative Komplikation der LAD Ligierung angesprochen: die Spannung Pneumothorax. Diese Methode, die die Notwendigkeit für die beiden zusätzlichen Einschnitte eliminiert in anderen Methoden-on verwendet wurde für die Tracheotomie und eine weitere für die Pleurapunktion-hat weniger postoperative Komplikationen ergaben und hat die Sterblichkeit drastisch reduziert.

Protokoll

Dieses Tier-Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) in Rhode Island Hospital überprüft und genehmigt.

1. Anästhesie und Intubation

1. Wiegen Sie die Maus, um die Dosierung von postoperativen Schmerzmitteln zu berechnen.
2. Platzieren Sie die Maus in eine Ansaugkammer und liefern 4% Isofluran für 9 - 10 min, Überwachung des Tieres im gesamten. Schalt auf einem heißen bead Sterilisator so daß die Vorrichtung auf etwa 250 ° C vorwärmen kann. 20 min - Vorglühen wird 15 nehmen.
3. Sobald die Maus eine tiefe Ebene der Anästhesie erreicht, mit einer Atemfrequenz von etwa 32 Atemzüge / min, legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine Styroporplatte und ein Gummiband unter den oberen Schneidezähnen befestigt verwenden, um die Mündung offen zu halten. Bestätigen Sedierung durch einen Zeh Prise durchführen. Positionieren eine Hochintensitätsbeleuchtungseinrichtung oberhalb der Maus, so daß die Oropharynx kann sichtbar gemacht werden.
4. Verwenden einer gebogenen Pinzette die Klemmbacke zu öffnen, und ein anderes Paareine Zange, die Zunge aus dem Weg zu heben. Achten Sie darauf, während intubieren bei oder leicht unterhalb der Augenhöhe mit dem Körper der Maus positioniert. Die Verwendung von Lupenbrillen wird empfohlen.
5. Visualisieren Sie das Öffnen und Schließen der Stimmbänder. Wenn geöffnet ist, kann eine 20-Gauge, 1-in intravenöser (IV) Katheter mit einer stumpfen Spitze-Nadeleinführungs. Verwenden Sie die Nadel den Katheter zu der Trachealöffnung zu führen, aber zu vermeiden, um die Nadel in die Trachea eingeführt wird. Überprüfung der korrekten Platzierung kann mit einem Kunststoff Transferpipette erfolgen.
6. Übertragen der intubierte Maus an eine Bedienfläche mit einer Heizvorrichtung ausgestattet. Schließen Sie die Maus auf ein kleines Nagetier Beatmungsgerät auf einem Hubvolumen von 150 ul / Hub und einer Hubzahl von 130 Hüben / min.
7. Liefern 2,5% Isofluran. Überprüfen Sie die Intubation durch bilaterale Brust führen zu überprüfen. Stellen Sie sicher, Anästhesie durch eine Zehe Prise durchführen. Die Maus muß von 5 bis 10 min auf dem Beatmungsgerät vollständig betäubten werden.

2. Vorbereiten der Maus

1. Klebeband auf den Intubationstubus an der Verbindungsstelle zwischen dem Beatmungsgerät und dem IV-Katheter. Band nach unten den Extremitäten. Platzieren sterile Schmier Tropfen auf den Augen.
2. Schneiden Sie die ventrale linke Seite des Thorax mit einem elektrischen Rasierapparat. Staub die rasierte Fell mit trockenen Tüchern ab und geben Sie eine kleine Schicht von Enthaarungscreme ein steriles Wattestäbchen. 45 s - Die Creme sollte für etwa 30 mit den Haarfollikeln in Kontakt bleiben.
3. Während die Prozesse Creme, legen drei sterilen Wattestäbchen in drei 1,5-ml-Röhrchen mit Betadine gefüllt einweichen. Mit Tüchern mit destilliertem Wasser befeuchtet, wischen Sie die Creme und Fell entfernt.
4. Reinigen Operationsfeld dreimal abwechselnd Betadine und steriles 70% Isopropanol prep pads, in einer kreisförmigen Bewegung der Reinigung vom Zentrum zur Peripherie bewegt. Legen Sie eine sterile Abdeckung mit einem Viertel großen Loch über das Operationsfeld der Maus.
5. Reinigen Sie den Bereich rund um das mouse mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, Anästhesie noch einmal mit einer Zehe Prise.

3. LAD Ligierung

1. Platzieren Sie die autoklaviert chirurgischen Instrumente in heissem bead Sterilisator vorgewärmt auf 250 ° C für ca. 20 s. Legen Sie die sterilisierten Instrumente auf sterile autoklavierten chirurgischen Tuchs. Don OP-Handschuhe.
2. Verwenden fein Spitze einer Pinzette vorsichtig auf die Haut an einem Punkt ungefähr 5 mm links von dem prominent xiphoid Knorpel zu heben. Verwenden, um ein chirurgisches Skalpell mit einer Klinge No. 10 nach oben einem vertikalen Schnitt in der Haut von diesem Punkt zu schaffen, auf das Niveau des Manubrium.
3. Verwenden einer gebogenen Pinzette vorsichtig auf die Haut und Muskelschichten zu trennen. Öffnen Sie die Muskelschicht, nach dem Hautschnitt. Legen zwei 5-0 Polypropylennahtmaterial durch die Muskelschicht, eine auf jeder Seite des Einschnitts, und befestigen die Nähte vorübergehend mit Klemmen der Muskelschicht offen zu halten.
4. Identifizieren und einen Einschnitt machen in der dritten Intercostalraum, nach demnatürliche Winkel des Brustkorbs. Entfernen Sie das Klebeband von dem linken Enden der Maus und sichern ihren linken hinteren Fuß auf seinen rechten hinteren Fuß mit Klebeband. Geschnitten, um ein längeres Stück Klebeband und sichern seinen linken vorderen Fuß zur Bedienfläche in einer leicht erhöhten Position. Reinigen Sie die Handschuhe mit 70% Ethanol.
5. Verwenden einen Retraktor , um sanft die ^3. und ^4. Rippen gespreizt. Geschnitten, um einen kleinen Abschnitt des sterilen Gaze, ungefähr 1 ½ in x in, und tauchen sie in steriler 0,9% Kochsalzlösung. Squeeze-out die überschüssige Salzlösung und Pinzette vorsichtig auf die Gaze gegen die linke Lunge einsetzen, um ein versehentlichen Verschlucken Lungenschäden während des Verfahrens zu verhindern.
6. Entfernen Sie vorsichtig den dünnen Perikard mit einer Pinzette.
7. Reißt eine geringe Menge an Baumwoll aus einem sterilen Wattestäbchen und rollen sie in eine kleine Kugel. Tauchen diesen Wattebausch in sterile 0,9% Salzlösung und sanft Tupfer über die Oberfläche des Herzens, die Arterien zu schätzen wissen. Sie vorsichtig die linke Ohrmuschel nach oben drücken und suchen Sie die Koronararterien unterunter.
8. Identifizieren der LAD und passieren eine 8-0 Nylonnaht unter der LAD; komplette zwei führt die Ligation zu sichern. Wenn die Unterbindung erfolgreich ist, die linke Ventrikel distal von der Ligatur Willen erbleichen.
9. Mit einer Pinzette, entfernen die Gaze früher eingesetzt und dann die Aufrollvorrichtung sanft entfernen. Legen Sie einen 6-in, 25-gauge flexiblen Schlauch an eine 25-Gauge-Nadel in die Brusthöhle durch die Öffnung Thorakotomie. Vorzurücken etwa 1 bis 2 in der Rohrleitung in den Raum oberhalb der linken Lunge. Bringen Sie die Maus auf eine Rückenlage und reinigen Sie die Handschuhe mit 70% Ethanol.
10. Verwenden Sie 5-0 Polypropylen Nähen in einem einfachen unterbrochenen Muster den Brustkorb zu schließen, um die Brust Rohr an Ort und Stelle zu halten. Entfernen Sie die beiden Fäden hält die Muskelschicht offen. Verwenden 5-0 Polypropylennahtmaterial in einem einfachen kontinuierlichen Muster die Muskelschicht zu schließen, was wiederum die Thoraxtubus anstelle halten.
11. Anhänge eine 1-ml-Spritze in die 25-Gauge-Nadel auf der Brust Rohr. Ziehen Sie nach oben auf dem Sprungr beim Extrahieren gleichzeitig allmählich die Thoraxtubus aus der Brusthöhle mit einer Pinzette. Extrahieren der Schlauch langsam, da dieser Schritt überschüssige Luft und Blut entfernt, die sonst geworden wäre in der Brusthöhle und das Ergebnis in einem Pneumothorax gefangen.
12. Sobald die Spritze voll ist, könnte die Spritze von der Nadel, und entsorgen den Abfall in einem Abfall Becher oder Waschbecken. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Brust Rohr vollständig extrahiert wird. Stellen Sie sicher, dass die Brust dicht verschlossen ist.
13. Verringern Sie die Isofluran auf 1,5%. Schließen Sie die Haut mit 4-0 Polypropylen Nähte in einem einfachen unterbrochenen Muster. Schalten Sie die Isofluran-Verdampfer ab.
14. Verabreichen, 0,1 mg / ml Buprenorphin in 0,9% Kochsalzlösung über eine intraperitoneale (IP) Injektion. gilt Topisch 2 mg / ml Lidocain mit 2 mg / ml Bupivacain in 0,9% Kochsalzlösung auf den Einschnitt. Administrieren zwischen 200-500 & mgr; l von 0,9% Salzlösung über eine subkutane Injektion, die Salzmenge auf das Gewicht der Maus skaliert werden.
15. Warten 5 min nach administering die Schmerzmittel die Maus vom Intubationsschlauchs zu entfernen. Dies hilft beim Übergang vom Ventilator.
    1. Wenn die Maus nicht ein bilaterales Brust führt einmal hat aus dem Beatmungsgerät, führt Nadel Dekompression. Um dies zu tun, führen eine 25-Gauge - Nadel und einer sterilen 1-ml - Spritze zwischen den ^3. und ^4. Rippen , bis sie die Brusthöhle eintritt, durch eine plötzliche Abnahme des Widerstands bezeichnet. Ziehen Sie vorsichtig auf den Kolben nach oben, um überschüssige Luft zu entfernen.
16. Wenn die Maus eine ausreichende bilaterale Atemfrequenz und Tiefe zeigt, und reagiert auf eine Zehe Prise, legen Sie die Maus in einem sauberen Erholungskäfig unter einer Wärmelampe. Geben Sie die Maus mit feuchter Nahrung und einer Wasserflasche, die Überwachung in einer laminaren Strömungshaube 15 - 20 min. Monitor für eine übertriebene Atemarbeit, starke Blutungen oder andere potenziell lebensbedrohlichen Komplikationen.
17. Für die nächsten drei Tage, verwalten 0,1 mg / ml Buprenorphin Schmerzmittel über ein IP inzweimal täglich jection. Überwachen Sie die Maus täglich.

Ergebnisse

Die Mäuse werden 28 Tage nach der Operation getötet, und die Herzen werden geerntet und untersucht. Die Mäuse werden betäubt mit 50-75 mg / kg Ketamin und von 5 bis 10 mg / kg Xylazin. Wenn das Tier unter adäquater Anästhesie ist, wird der Brustraum geöffnet wird, und unter Verwendung einer 23-Gauge-Nadel, kalte Kaliumchlorid (KCL, 30 mM) wird in den hinteren basalen Bereich des Herzens injiziert. Das Herz wird in der Diastole verhaftet. Für weitere Validierung der Ligation wird ...

Diskussion

Mit zunehmender Nutzung des MI-Modells in Laboratorien, sucht das beschriebene Verfahren der Effizienz und die Überlebensrate der Mäuse zu erhöhen, während ihre postoperativen Schmerzen und Beschwerden zu minimieren. Dieses Protokoll ist bestrebt, indem sie zahlreiche Verbesserungen an verschiedenen Aspekten der LAD-Ligation Verfahren Mortalität zu minimieren. Es gibt ein paar Unterschiede. Einige Mäuse - Intubation Studien , die Ketamin und Xylazin zusammen mit Isofluran für Induktion nutzen, au...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225