Мышиная левая передняя нисход (ЛАД) аортокоронарное Лигирование: Улучшенная и Простая модель инфаркт миокард

Резюме

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца (ИБС), или острый коронарный синдром (ОКС), является одной из ведущих причин смерти в Соединенных Штатах. ИБС характеризуются снижением кровоснабжения сердца, что приводит к потере кислорода к и последующему некрозу сердечной мышцы. Модель MI приобрела популярность для использования в качестве краткосрочной модели ишемии-реперфузии и долгосрочной модели постоянного лигирования. Ниже мы опишем надежный метод постоянной перевязки ЛАДА. С мыши генной инженерии технология становится более продвинутым, и с увеличением доступности качественных мышиных хирургических инструментов, мышь стала популярной моделью для УИ операций. Наша хирургическая модель включает в себя использование легко обратимой анестетики для быстрого восстановления мыши; минимально инвазивная эндотрахеальная интубация без привлечения трахеотомии; и плевроцентоз через оригинальный сайт торакотомии без создания дополнительного разреза в груди, каксделано в некоторых других методах, чтобы эффективно удалить лишнюю кровь и воздух из полости грудной клетки. Этот метод является сравнительно менее инвазивным, чем другие методы, которые значительно снижают хирургические и послеоперационные осложнения и смертность и улучшают воспроизводимость.

Введение

Ишемическая болезнь, или ACS, является самым распространенным сердечно - сосудистых событий и будет считаться основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире в 2020 году ^1. Причиной ACS является наличие инфаркта тромбоза из - за разрыва коронарных атеросклеротических бляшек , который блокирует или уменьшает приток крови к ткани сердца ^2. Таким образом, имеются клинические признаки , согласующиеся с наличием острой ишемии миокарда, такие как инфаркт миокарда (ИМ) ^{3, 4.} МИ приводит к потере массы кардиомиоцитов и прогрессированию патологического ремоделирования желудочков, что может привести к дисфункции желудочка и сердечной недостаточности ^{5, 6.}

Одним из наиболее эффективных способов изучения ИБС были имитировать инфаркт миокарда человека в животной модели. Это достигается за счет окклюзии LAD вмышей. Используя эту модель, мы изучаем, как сердце может быть защищено от повреждений в результате ИБС.

За последнее десятилетие исследователи перешли от использования более крупные животные моделей для мелких животных, в том числе перехода от крыс к мышам. Меньше , мышиная модель начинает быть предпочтительным по многим причинам, в том числе их небольшого размера, большого размера помета, низкая стоимость , чтобы поддержать, и короткий период беременности, а также для экспансивной наличия трансгенных и нокаут гена моделей ^7. Хотя мыши имеют небольшие размеры, новые хирургические инструменты, специально разработанные для них помогли в этом развитии. Наш метод использует эти новые хирургические инструменты.

Хотя несколько методов реализация инвазивной трахеотомии, мы используем менее инвазивный метод интубации трахеи. Использование накладных освещения ротоглотки, мы интубация без создания каких-либо разрезов, обеспечивая более безопасный и менее травмирующий опыт для тон животное. Затем мышь помещали на искусственной вентиляции легких и продолжал изофлуран в течение всей процедуры. Из-за короткую продолжительность анестезии, производимых наркотиками, это займет всего несколько минут животного, чтобы оправиться от наркоза после его прекращения. Наша хирургическая модель также включает в себя минимально инвазивной Плевроцентоз. Тщательное удаление крови и избыточного воздух из полости грудной клетки, используя Плевроцентоз через оригинальные торакотомии разрез обратилось общее послеоперационное усложнение ЛАДА перевязки: натяжной пневмоторакс. Этот метод, который исключает необходимость в двух дополнительных разрезах, используемых в других методах-один для трахеотомии, а другой для торакоцентеза-дали меньшего число послеоперационных осложнений и привел к резкому снижению смертности.

протокол

Этот протокол животное было рассмотрено и одобрено Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в больнице Род-Айленд по.

1. Анестезия и интубации

1. Взвесьте мышь, чтобы рассчитать дозировку послеоперационного обезболивающего.
2. Поместите мышь в индукционной камере и доставить 4% изофлуран в течение 9 - 10 мин, наблюдение за животным во всем. Включите горячую шарик стерилизатор, так что устройство может предварительно нагреть до приблизительно 250 ° С. Предварительный нагрев займет 15 - 20 мин.
3. После того, как мыши достигает глубокой плоскости анестезии, с частотой дыхания приблизительно 32 вдохов / мин, поместите лежачем мыши на борту пенополистирола и использовать резинку, прикрепленную под верхними резцами, чтобы держать рот открытым. Подтвердите седации, выполняя носок щепотку. Установите на осветитель высокой интенсивности выше мыши, так что ротоглотки могут быть визуализированы.
4. Использование изогнутых щипцов, чтобы открыть челюсти и другую парущипцов поднять язык пути. Убедитесь, что в то время интубации расположена на или чуть ниже уровня глаз с телом мыши. Рекомендуется использование хирургических луп.
5. Визуализируйте открытие и закрытие голосовых связок. При открытии вставки 20-го калибра, 1-в внутривенного (IV) катетера с тупым наконечником иглы интродьюсера. Используйте иглу, чтобы направлять катетер в отверстие трахеи, но избежать введения иглы в трахею. Проверка правильного размещения может быть сделано с помощью пластиковой пипетки передачи.
6. Передача интубированного мышь к рабочей поверхности, снабженной нагревательным устройством. Подключите мышь к небольшому грызуна вентилятора, установленного на ударный объем 150 мкл / хода и скорости хода 130 ударов / мин.
7. Deliver 2,5% изофлуран. Проверьте интубации путем проверки двустороннего подъема груди. Проверка анестезии, выполняя носок щепотку. Мышь может потребоваться 5 - 10 мин на вентиляторе, чтобы стать полностью наркозом.

2. Подготовка мыши

1. Лента вниз интубации трубки на соединительном участке между вентилятором и IV катетера. Ленточный вниз конечностей. Поместите стерильные смазывающие капли на глазах.
2. Обрежьте вентральную левую сторону грудной клетки с электрической бритвой. Пыль от бритого меха с сухими салфетками и нанести небольшой слой крема для удаления волос с помощью стерильного ватного тампона. Крем должен оставаться в контакте с волосяными фолликулами в течение примерно 30 - 45 с.
3. В то время как процессы крема, поместить три стерильные ватные тампоны в три 1,5-мл пробирки, наполненной Бетадин, чтобы впитать. С помощью салфетки, смоченной дистиллированной воды, аккуратно вытереть крем и мех.
4. Очистить операционное поле три раза, чередуя Бетадин и стерильной 70% изопропанол приготовительных колодки, чистку в круговом движении движущегося от центра к периферии. Поместите стерильную драпировку с четвертью размером дыры над операционным полем мыши.
5. Очистите область вокруг МОВе с 70% -ным этанолом. Проверьте наркоз еще раз с бордюрным крайним случаем.

3. ЛАД Лигирование

1. Поместите автоклавные хирургические инструменты в горячем стерилизаторе шарика, предварительно нагретых до 250 ° С в течение приблизительно 20 с. Поместите простерилизованные инструменты на стерильном автоклавного хирургической простыне. Донские хирургические перчатки.
2. Использование тонкого кончика пинцета осторожно поднимите кожу в точке примерно на 5 мм слева от известного мечевидного хряща. Используйте хирургический скальпель с № 10 лезвием, чтобы создать вертикальный разрез в коже от этой точки вверх, до уровня рукоятки.
3. Использование изогнутых щипцов, чтобы аккуратно отделить кожу и мышечные слои. Открыть мышечный слой, после разреза кожи. Вставьте две 5-0 полипропиленовых швы через мышечный слой, по одному с каждой стороны разреза, и закрепить швы временно с помощью зажимов, чтобы держать мышечный слой открытым.
4. Выявление и сделать надрез в третьем межреберье, следуяестественный угол грудной клетки. Снимите ленту с левой конечности мыши и закрепить его левую заднюю лапку в правую заднюю ногу с лентой. Вырезать длинный кусок ленты и закрепите левую переднюю ножку к рабочей поверхности в слегка приподнятой позиции. Почистите перчатки с 70% этанола.
5. Используйте втягивающий осторожно раскрывайте 3 - ^й и 4 - ^я ребро. Вырезать небольшой участок стерильной марли, приблизительно 1 дюйм х ½ дюйма, и погрузить его в стерильном 0,9% физиологического раствора. Выжмите избыток раствора и использовать пинцет, чтобы аккуратно вставить марлю против левого легкого, чтобы предотвратить случайное повреждение легких во время процедуры.
6. Аккуратно снимите тонкий перикард с пинцетом.
7. Оторвите небольшое количество хлопка от стерильного ватного тампона и раскатать его в маленький шарик. Dip этого ватного тампона в стерильный 0,9% -ный солевой раствор и аккуратно тампон по поверхности сердца, чтобы оценить артерии. Аккуратно нажмите левую ушную раковину вверх и найти коронарные артерии приНит.
8. Определить ЛАД и передать шовный материал 8-0 нейлона под LAD; полный два броска, чтобы обеспечить перевязку. Если перевязка успешно, левый желудочек дистальнее лигатуры воли бланшируют.
9. С помощью пинцета удалите марлю вставленную ранее, а затем аккуратно удалить втягивающий. Вставка 6-в, 25-калибровочной гибкая трубка, прикрепленная к 25-калибровочной игле в грудной полость через отверстие торакотомии. Advance приблизительно 1 - 2 в насосно-компрессорных трубах в указанное выше левом легком пространство. Верните мышь в положении лежа на спине и чистить перчатки с 70% этанола.
10. Используйте 5-0 полипропиленовых швы в простом прерванном шаблоне, чтобы закрыть грудную клетку, держа трубку в груди на месте. Удалите два швов, крепящих мышечный слой открыты. Используйте 5-0 полипропиленовые швы в простой непрерывной картине, чтобы закрыть мышечный слой, опять же держа трубку в груди на месте.
11. Приложить 1-мл шприц с 25-го калибра иглы на трубке в грудной клетке. Осторожно потяните вверх на погружениег, одновременно постепенно извлекая грудь трубку из полости грудной клетки с щипцами. Извлеките трубку медленно, как этот шаг удаляет избыток воздуха и крови, которые в противном случае стало бы в ловушке в грудной полости и в результате пневмоторакса.
12. После того как шприц заполнен, отсоединить шприц от иглы и утилизация отходов в химическом стакане с отходами или раковину. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока грудь трубка полностью извлечена. Убедитесь в том, что грудь плотно запечатана.
13. Уменьшение изофлурана до 1,5%. Закройте кожу 4-0 полипропиленовых швов в простом прерванном рисунке. Включите изофлуран испарителя выключен.
14. Администрирование 0,1 мг / мл бупренорфинов в 0,9% физиологическом растворе с помощью внутрибрюшинного (IP) введения. Местно применяют 2 мг / мл лидокаина с 2 мг / мл бупивакаина в 0,9% солевом растворе до разреза. Администрирование между 200 - 500 мкл 0,9% физиологического раствора с помощью подкожной инъекции, масштабирование количества солевого раствора к массе мыши.
15. Подождите, через 5 мин после AdminiStering на обезболивающих, чтобы удалить мышь из интубации трубки. Это помогает при переходе выключенного вентилятора.
    1. Если мышь не имеет двусторонний увеличения груди сразу от ИВЛ, выполнить иглы декомпрессии. Чтобы сделать это, ввести 25 калибра стерильную иглу и шприц 1-мл между 3 - ^м и 4 - ^м ребрами , пока она не войдет в грудную полость, обозначаемый внезапным уменьшением сопротивления. Потяните осторожно на поршень, чтобы удалить избыток воздуха.
16. Когда мышь демонстрирует адекватную двустороннюю частоту дыхания и глубину и реагирует на носок щепотку, поместите мышь в чистой клетке восстановления под нагревательной лампой. Обеспечить мышь с влажной пищей и бутылки с водой, мониторинг в ламинарном проточном боксе в течение 15 - 20 мин. Монитор для преувеличенного усилия дыхания, чрезмерного кровотечения, или других потенциально опасной для жизни осложнений.
17. В течение следующих трех дней, вводить 0,1 мг / мл бупренорфина обезболивающее через IP вjection два раза в день. Монитор мыши ежедневно.

Результаты

Мышей умерщвляли через двадцать восемь дней после операции, и сердца собирают и исследуют. Мышей анестезируют с помощью 50 - 75 мг / кг кетамина и 5 - 10 мг / кг ксилазина. Когда животное находится под адекватной анестезией, грудная полость открыта, и с использованием 23-иглы к...

Обсуждение

С увеличением использования модели MI в лабораториях, описанная процедура направлена ​​на повышение эффективности и выживаемости мышей, минимизируя их послеоперационную боль и дискомфорт. Этот протокол стремится свести к минимуму смертности, делая многочисленные улучшения в различ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Intensity Light Source	Harvard Apparatus	72-0215
SurgiSuite Operating Platform	Kent Scientific Corporation	SurgiSuite	Uses a rechargeable, battery-operated far infrared warming pad. Charge overnight before surgery.
SurgiSuite LED Lighting Kit	Kent Scientific Corporation	SURGI-5003
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Preheating takes 15 - 20 min. Instruments take 20 s to sterilize.
Small Rodent Anesthesia System	VetEquip Inc.	901810
Isofluorane	Piramal Enterprises	66794-017-10
Buprenorphine	Rhode Island Hospital Pharmacy	NDC 12496-0757-1, 12496-0757-5
Surgical Loupes	Roboz	RS-6687
Small Rodent Ventilator	Harvard Apparatus	73-0043
Lubricating Drops	Thermo Fisher Scientific	19-898-350
Electric Razor	Kent Scientific Corporation	CL 9990-1201
Hair Removal Cream	Nair
Medical Tape	Thermo Fisher Scientific	18-999-380
Betadine	Thermo Fisher Scientific	19-027136
70% Isopropanol Wipes	Thermo Fisher Scientific	22-363-750
Surgical Drapes	Braintree	SP-TS
Surgical Gloves	Thermo Fisher Scientific	18999102D
5-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8630G
8-0 Nylon Sutures	Fine Science Tools	12051-08
Platinum-Cured Tubing	Harvard Apparatus	72-1042	0.3 mm inside diameter x 0.6 mm outside diameter
0.9% Saline	Thermo Fisher Scientific	19-310-207
4-0 Polypropylene Sutures	Ethicon	8631G
1 CC Syringe with 25-Gauge Needle	Thermo Fisher Scientific	14-826-100
Scissors	Kent Scientific Corporation	INSS600225
Forceps	Kent Scientific Corporation	INS700100
Cotton Swabs	Thermo Fisher Scientific	23-400-118
IV Catheter, 20-Gauge	Thermo Fisher Scientific	NC9892181
Retractor	Kent Scientific Corporation	INS 750369
Forceps	Fine Science Tools	11003-12
Dissecting Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 700101
Dissecting Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 700103
Hemostatic Forceps, Straight	Kent Scientific Corporation	INS 750451
Hemostatic Forceps, Curved	Kent Scientific Corporation	INS 750452
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS 700131
Needle Holder	Kent Scientific Corporation	INS 600109
Scissors	Kent Scientific Corporation	INS 600225