变凹形形状 Microwells 的配对磁珠和磁体阵列

摘要

本文介绍了一种在不需要复杂的高成本设备的情况下, 制作凹 microwells 的鲁棒方法。采用磁力、钢珠和通孔阵列, 在 3 cm x 3 cm 烷 (microwells) 衬底上形成几百个。

摘要

椭球区域性是理解细胞行为的有用工具, 因为它提供了一个在体内类似的三维环境。各种球体的生产方法, 如无粘结表面, 微调烧瓶, 悬挂滴, 和 microwells 已被用于研究细胞间的相互作用, 免疫活化, 药物筛选, 干细胞分化, 和化生成。在这些方法中, microwells 与三维凹几何已经得到了科学家和工程师的注意, 由于他们的优势, 统一大小的球体生成和轻松的反应, 个别椭球可以监测.尽管提出了使用柔性膜和冰光刻等成本效益高的方法, 但这些技术存在着严重的缺点, 如难以控制模式尺寸、实现较高的长宽比和生产大面积的 microwells。针对这些问题, 提出了一种在不需要复杂的高成本设备的情况下制作凹 microwells 的鲁棒方法。该方法利用了 30 x 30 通孔阵列、几百微米级的钢珠和磁力, 在 3 cm x 3 cm 烷 (microwells) 基底上制造了900个。为了证明我们的方法对细胞生物学应用的适用性, 我们培养脂肪干细胞3天, 成功地生产椭球使用我们的微平台。此外, 我们进行了一个静磁场模拟研究的机制, 即磁力被用来捕获钢珠在通孔。我们认为, 所提出的微制备方法可以应用于许多基于球体的细胞研究, 如药物筛选、组织再生、干细胞分化和肿瘤转移。

引言

生长成球状形态的细胞比二维平面区域性¹更类似于实体组织。考虑到这一优势, 采用椭球的方法来改善细胞与细胞相互作用的研究^2,3, 免疫激活⁴, 药物筛选⁵, 和差异性⁶。此外, 椭球结合多种细胞类型最近已应用于 organoids (近生理三维 (3D) 组织), 这是非常有用的研究人类发展和疾病⁷。几种方法已被用于生产椭球。最简单的方法是利用非粘合表面, 使细胞聚集在一起, 形成椭球。培养皿可以用牛血清白蛋白、pluronic F-127 或疏水性聚合物 (如聚 2-乙甲基丙烯酸酯) 来处理, 使其表面不粘附^{8, 9}。微调烧瓶方法是另一种众所周知的生产大量椭球^10,11的方式。在这种方法中, 细胞通过搅拌来保持悬浮, 以防止它们附着在基体上。相反, 浮动单元格聚合以形成椭球。无粘结面法和微调瓶法均能产生大量的椭球。但是, 它们受到限制, 包括控制球体尺寸的困难, 以及每个球体的跟踪和监测。作为对此类问题的一种补救方法, 另一种球形生产方式, 即悬挂跌落法可以采用¹²。这包括将细胞悬浮液沉淀在培养皿盖子的下侧。这些下落通常是15到30µL 在大小并且包含大约300到3000个细胞¹³。当盖子是倒置的, 下落由表面张力举行。每个下落的微重力环境集中细胞, 然后形成唯一椭球在自由的液体空气接口。悬挂下降法的优点是它提供了一个受控的大小分布, 而它很容易跟踪和监测每个球体, 相对于非胶粘剂表面和微调烧瓶的方法。然而, 这种方法在椭球的大量生产和生产过程本身是过度劳动密集型的情况下产生了一个不利因素。

微阵列是一个平板, 有许多微尺寸的井, 每一个直径不等, 从100到1000µm。在使用 microwells 时, 球体的生产原理与非粘性表面方法相似。好处包括 microwells 提供空间之间的 microwells 分离的细胞或椭球, 这样, 它是易于控制的球体大小, 同时也使它易于监测每个单一的球体。随着大量的 microwells, 高吞吐量球体的生产也成为可能。microwells 的另一个优势是根据用户独特的实验目的, 选择不同形状的水井 (六面体、圆柱形、三角形棱柱)。然而, 一般来说, 一个三维 (3D) 凹 (或半球) 形状被认为是最适合生产统一尺寸的单椭球。因此, 凹 microwells 的用处已经报告了许多细胞生物学研究, 如那些检测胚胎干细胞分化的心肌细胞¹⁴, 胰岛细胞簇的胰岛素分泌,¹⁵,肝细胞酶活性为¹⁶, 肿瘤耐药性椭球¹⁷。

不幸的是, 制作 microwells 往往需要专门的微设施;传统的光刻方法需要曝光和开发设备, 而反应离子蚀刻的方法需要等离子和离子束设备。这类设备费用高昂, 加上复杂的制作过程, 给无法进入微的生物学家带来了高门槛。为了克服这些问题, 提出了其他成本效益高的方法, 如冰光刻¹⁸ (使用冷冻水滴) 和柔性膜法¹⁴ (使用膜、通孔衬底和真空)。然而, 这些方法也有严重的缺点, 如难以控制的模式大小, 实现高宽比, 和生产大面积 microwells。

为了克服上述问题, 我们提出了一种新的凹微制造方法, 利用孔基板、钢珠和磁铁阵列。利用这种方法, 利用磁力辅助的自锁金属珠 (图 1) 的机理, 可以制作数以百计的凹球形 microwells。制作过程涉及使用极少数昂贵和复杂的设施, 不需要许多先进的技能。因此, 即使是不熟练的人也很容易承担这种制作方法。为了证明所提出的方法, 在凹 microwells 培养人脂肪干细胞, 产生椭球。

研究方案

1. 通过孔阵列铝板和磁铁阵列的制备

1. 准备两个50毫米 x 50 毫米 (或更大) 的铝板。每个板材的厚度为300µm, 是珠粒直径的一半。
2. 在其中一个铝板上形成一个 30 x 30 通孔阵列, 使用带有Φ550µm 微钻头的 CNC 旋转雕刻机, 其转速为30毫米/秒, 主轴速度为 8000 RPM。每个孔之间的距离 (中心到中心) 是 1 mm (图 1a和图 2a, i)。
3. 使用与 1.2 (图 1a和图 2a, ii) 中描述的程序相同的步骤, 在其他铝板上形成一个 30 x 30 阵列的Φ750-µm 通孔。
4. 在两个铝板的四角上, 使用粘胶带和形成Φ3 mm 对齐孔, 以彼此连接这两个板块。
5. 在15% 硫酸中浸泡12小时的铝板以清洁其表面。由于铝表面的薄层氧化铝使其具有耐腐蚀性, 因此该酸处理不会改变板材的孔径和厚度。
6. 形成一个 30 x 30 阵列的1个 1 x 1 毫米钕磁铁 (具有磁性强度为 0.363 N)。确保每个磁铁是相反的极性对它的邻居。为了防止磁体阵列的破裂或散射, 使用双面胶带 (图 2a、 iii 和嵌入图 2) 将 30 x 30 mm 的铝板连接到磁体阵列的底部。

2. 磁珠捕集工艺

1. 对齐和堆叠两个铝板 (顶板: 750-µm 孔板, 底板: 550-µm 孔板) 使用准备的对准孔在每个板块的四角 (图 1b)。
2. 通过将 M3 螺栓插入对准孔中, 将两个板锁定在一起, 然后用螺母固定螺栓 (图 1b)。
3. 堆叠在准备好的磁铁阵列上的铝板组件 (图 1b, 2b和2c)。在堆叠过程中, 将磁体阵列与铝板上的孔阵列对齐。然后使用粘胶带固定磁铁阵列的位置。
4. 在板组件上放置足够数量的φ mm SUJ2 钢珠, 并使用丙烯 (或非金属) 板对珠子进行操作, 使珠子在每个孔 (图 1c、 1d和1e) 同时被困住去除未在孔中的多余的珠子。
5. 小心取下顶部板, 以避免不必要的散射和错位的珠子 (图 1f)。

3. 凹微制造

1. 移动凹微模具, 生产步骤2.1 至 2.5, 以上, 以培养皿。
2. 混合烷 (硅橡胶) 单体和固化剂根据制造商的指示¹⁹与一个硅氧烷单体: 固化剂比10:1。
3. 通过使用干燥和真空泵来除去在该混合物中被困住的气泡, 以消除气体的混合物。
4. 使用与 3.3 (图 1f) 中描述的过程相同的步骤, 将该混合物倒入凹微模和脱气中。
5. 在80° c 的板上烘烤 2 h 的硅氧烷混合物, 形成一个珠嵌入的硅橡胶衬底 (图 1g)。
6. 从模具 (图 1g) 中卸下固化的硅基板。在去除过程中, 用洗涤瓶喷涂甲醇从模具中分离出硅烷基板。
7. 使用 15 mm x 2 mm 磁铁, 从硅基板上取下被夹住的钢珠 (图 1h)。在这个过程中, 任何足够强的磁铁从硅氧烷基板中提取珠子都可以使用。

4. 球体培养

1. 在本研究中, 用 24-井板上的Φ14 mm 活检穿孔, 切割凹微图案的硅橡胶衬底。
2. 在121° c 和 15 psi 的高压灭菌器中消毒所产生的Φ14 mm 的硅基板。
3. 将灭菌后的硅基板置于24井盘中。
4. 用 4% (w/v) pluronic F-127 溶液将整个硅烷基板涂上一整夜, 防止细胞附着在微表面。在涂层过程中, 通过移或使用超声波清洗器, 去除凹 microwells 中的气泡。
5. 使用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗 F-127 溶液三次。
6. 种子1毫升的细胞介质 (Dulbecco 氏改良的鹰培养基) 解决方案 (其中包含 2 x 10⁶细胞) 在硅烷基板上。请注意, 播种密度可以根据目标球体的大小和/或目标细胞类型而改变。在这里, 脂肪来源的干细胞 (ASC) 被使用。
7. 用1000µL 吸管抽吸1毫升培养基, 以去除未被困在 microwells 中的多余细胞 (图 3)。
8. 孵育的细胞在36.5 ° c, 湿度的 > 95%, 和 5% CO₂条件。在我们的研究中使用的陶瓷的情况下, 细胞聚集到一个球体在48小时。

结果

通过以下步骤2.1 到 3.7, 成功地制作了凸模和微模式。(图 4)。商业钢珠被困在 30 x 30 通孔阵列。珠子被紧紧地抱着, 珠子和相应的通孔之间没有缝隙 (图 4a)。预制凹微的形状为凹半球形, 直径为600µm, 与钢珠相同 (图 4b)。凹微的横截面 (图 4c) 显示相邻微的距离为1毫米 (中心至中心), 与?...

讨论

这种制作方法面临的主要挑战是在铝板的通孔阵列中的珠子的安全固定。为了解决这一难题, 以 30 x 30 磁铁阵列的形式使用磁力来稳固地固定珠子, 如图 6和7所示。磁体阵列的磁通密度与极性相反, 在每个磁体表面的中心最强。因为磁力的强度取决于磁通密度, 所以珠子被引导到每个磁铁的顶面中心, 在那里他们被放置在位置。如果使用一个大尺寸的磁铁 (5 厘米 x 5 cm x 1 厘?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011