Eine gekoppelte Wulst und Magnet-Array zum Formen von Mikroschälchen mit variabler konkave Geometrie

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt eine robuste Methode zur Herstellung von konkaven Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Mit Magnetkraft, Stahlkügelchen und einer Durchgangsbohrung Array, bildeten sich mehrere hundert Mikrovertiefungen in ein 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat.

Zusammenfassung

Eine Sphäroid-Kultur ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der zellulären Verhalten, dass es eine in Vivobietet-wie dreidimensionalen Umgebung. Verschiedenen Sphäroid Produktionsmethoden stammen wie z. B. in Studien der Zell-Zell-Interaktion, immun-Aktivierung, Drogen-screening, nicht klebende Oberflächen, Spinner Fläschchen und hängenden Tropfen Mikrovertiefungen verwendet wurden Zelldifferenzierung und organoide Generation. Unter diesen Verfahren haben Mikrovertiefungen mit einer dreidimensionalen konkave Geometrie gewann die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler und Ingenieure, die aufgrund ihrer Vorteile Sphäroid Uniform mittlere Generation und die Leichtigkeit, mit der die Reaktionen der einzelnen Sphäroide werden kann überwacht. Obwohl kostengünstige Methoden wie der Einsatz von flexiblen Membranen und Eis Lithographie vorgeschlagen wurden, entstehen diese Verfahren gravierende Nachteile wie Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Muster-Größen und Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und Produktion von größere Bereiche der Mikrovertiefungen. Um diese Probleme zu überwinden, schlagen wir eine robuste Methode zur Herstellung von konkaver Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Diese Methode nutzt eine 30 x 30 Durchgangsbohrung Array, mehrere hundert Mikrometer-Bestellung Stahl Perlen und Magnetkraft, 900 Mikrovertiefungen in einem 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat zu fabrizieren. Um die Anwendbarkeit der unsere Methode, um Anwendungen in der Zelle Biologie demonstrieren, wir Fettgewebe Stammzellen für 3 Tage kultiviert und Sphäroide Nutzung unserer Microwell-Plattform erfolgreich produziert. Darüber hinaus führten wir eine magnetostatischen Simulation, um den Mechanismus zu untersuchen, wobei Magnetkraft Stahlkügelchen in die Durchgangsbohrungen auffangen verwendet wurde. Wir glauben, dass die vorgeschlagenen Microwell Herstellungsverfahren auf viele Sphäroid-basierten zellulären Studien wie Drogen-Screening, Geweberegeneration, Stammzelldifferenzierung und Krebsmetastasen angewandt werden könnte.

Einleitung

Zellen in einem Sphäroid Form gewachsen sind vergleichbar mit echten Gewebe im Körper als eine zweidimensionale planare Kultur¹. Angesichts dieser Vorteil, ist die Verwendung von Sphäroide angenommen worden, um die Untersuchung von Zelle zu Zelle Interaktion^2,3, immun-Aktivierung⁴, Drogen-screening-⁵und Differenzierung⁶zu verbessern. Darüber hinaus wurden Sphäroide Einbeziehung mehrerer Zelltypen vor kurzem auf Organellen (in der Nähe von physiologischen dreidimensionale (3D) Gewebe) angewendet, die sehr nützlich für das Studium der menschlichen Entwicklung und Krankheit⁷sind. Verschiedene Methoden wurden zur Sphäroide zu produzieren. Die einfachste Methode beinhaltet die Verwendung einer nicht klebenden Oberfläche, so dass die Zellen untereinander und Form Sphäroide aggregieren. Eine Petrischale können mit Rinderserumalbumin, Pluronic F-127 oder eine hydrophobe Polymer (z.B. Poly-2-Hydroxyethl-Methacrylat) zu seiner Oberfläche nicht klebend⁸⁹behandelt werden. Die Spinner-Kolben-Methode ist eine weitere bekannte Mittel zur Herstellung großer Mengen an Sphäroide^10,11. Bei dieser Methode werden Zellen von rühren zu verhindern, dass sie immer auf dem Untergrund befestigt in der Schwebe gehalten. Stattdessen, den schwimmenden Zellen Aggregat Form Sphäroide. Sowohl der nicht klebenden Oberfläche Methode und Spinner Kolben produzieren große Mengen an Sphäroide. Sie unterliegen jedoch Einschränkungen einschließlich Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Sphäroid-Größe sowie die Verfolgung und Überwachung der einzelnen Sphäroid. Als Heilmittel für solche Probleme, eine andere Sphäroid Produktionsmethode, nämlich die hängenden drop-Methode beschäftigt¹²sein können. Dies beinhaltet Hinterlegung Zelle Suspension Tropfen auf der Unterseite des Deckels einer Kulturschale. Diese Tropfen sind in der Regel 15 bis 30 µL in Größe und enthalten ca. 300 bis 3000 Zellen¹³. Wenn der Deckel umgekehrt wird, werden die Tropfen durch Oberflächenspannung gehalten. Der Schwerelosigkeit in jedem Tropfen konzentriert sich die Zellen, die bilden dann einzelne Sphäroide an der freien Flüssigkeit-Luft-Schnittstelle. Die Vorteile des Behangs Drop-Methode sind, dass es eine gut kontrollierte Größenverteilung bietet, während es ist leicht zu verfolgen und überwachen jede Sphäroid, bezogen auf die nicht klebende Oberfläche und Spinner Kolben Methoden. Jedoch verursacht diese Methode einen Nachteil, dass die massive Produktion von Sphäroide und des Produktionsprozesses selbst übermäßig Labor ist intensiver.

Ein Microwell-Array ist eine flache Platte mit vielen Mikro-Größe Brunnen, jeweils mit einem Durchmesser von 100 bis 1000 µm. Das Sphäroid Herstellungsprinzip Mikrovertiefungen Verwendung ist ähnlich dem der nicht klebenden Oberfläche Methode. Vorteile sind die Tatsache, dass die Mikrovertiefungen bieten Räume zwischen Mikrovertiefungen zur Abtrennung der Zellen oder Sphäroide, so dass es leicht zu Steuern der Sphäroid-Größe und gleichzeitig soll es einfach, jede einzelne Sphäroid zu überwachen. Mit einer großen Anzahl von Mikrovertiefungen ist Hochdurchsatz-Sphäroid Produktion auch möglich. Ein weiterer Vorteil des Mikroschälchen besteht die Möglichkeit, Form-Brunnen in verschiedenen Formen (hexaedrischen, zylindrisch, trigonal prismatisch) abhängig von den Benutzern einzigartige experimentelle Zwecke. In der Regel jedoch eine dreidimensionale (3D) konkave (oder halbkugelförmige) Form gilt als am besten geeignet für die Herstellung von einzelnen Sphäroide Uniform-Größe. Deshalb die Nützlichkeit der konkaven Mikrovertiefungen berichtet für viele Zelle Biologie Studien wie die Prüfung der Cardiomyocyte Differenzierung von embryonalen Stammzellen¹⁴, die Insulinsekretion von Inselzelle Cluster¹⁵, die enzymatische Aktivität von Hepatozyten¹⁶und die Resistenz des Tumors Sphäroide¹⁷.

Leider erfordert die Herstellung von Mikrovertiefungen oft spezialisierten Micropatterning Einrichtungen; konventionellen Fotolithografie basierenden Methoden erfordern Belichtung und Entwicklung Einrichtungen während reaktive Ionen-Ätzen-basierte Methoden Plasma und Ionenstrahl-Ausrüstung benötigen. Solcher Geräte ist kostspielig, die zusammen mit der komplizierten Fertigung eine hohe Eintrittsbarriere für Biologen präsentiert, die keinen Zugang zu Mikrotechnik. Um diese Probleme zu überwinden, andere kostengünstige Methoden wie z. B. Eis Lithografie¹⁸ (mit gefrorenen Wassertropfen) und der flexiblen Membran Methode¹⁴ (mit einer Membran, Durchgangsbohrung Substrat und ein Vakuum) vorgeschlagen worden. Diese Methoden entstehen jedoch auch gravierende Nachteile wie es schwierig, die Muster-Größen, die Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und die Produktion von größeren Bereich Mikrovertiefungen zu kontrollieren.

Um die oben genannten Probleme zu überwinden, schlagen wir eine neuartige konkave Microwell Herstellungsverfahren unter Verwendung einer Durchgangsbohrung Substrat, Stahlkügelchen und ein Magnet-Array. Mit dieser Methode können Hunderte von konkaven sphärischen Mikrovertiefungen hergestellt werden, unter Ausnutzung des Mechanismus der magnetischen Kraft unterstützt Selbsthemmung metallischen Perlen (Abbildung 1). Der Produktionsprozess beinhaltet die Verwendung von sehr wenige teure und komplizierte Einrichtungen und verlangt nicht viele fortgeschrittene Fähigkeiten. Als solche können auch ungelernte Personen dieses Herstellungsverfahren leicht durchführen. Um die vorgeschlagene Methode zu demonstrieren, wurden menschliche Fettgewebe-Stammzellen in konkaven Mikrovertiefungen Sphäroide produzieren kultiviert.

Protokoll

1. Vorbereitung der Durchgangsbohrung Array Aluminium-Platte und Magnet-array

1. Bereiten Sie zwei 50 mm x 50 mm (oder größer) Aluminium-Platten. Die Dicke jeder Platte war 300 µm, die Hälfte des Durchmessers Perle ist.
2. Bilden Sie ein 30 x 30 Durchgangsbohrung Array auf einem Aluminium-Platten mit einer CNC-Dreh Stecher mit einem Φ550-µm Mikro Bohrer mit 30 mm/s Sprung und 8000 u/min der Spindeldrehzahl. Der Abstand zwischen jedem Loch (Mitte zu Mitte) war 1 mm (Abb. 1a und Figur 2a, ich).
3. Bilden Sie ein 30 x 30-Array von Φ750-µm Durchgangsbohrungen auf andere Aluminium-Platte, mit dem gleichen Verfahren wie in 1.2 (Abbildung 1a und Figur 2a, Ii) beschrieben.
4. Befestigen Sie den beiden Platten aufeinander mit einem Klebeband und bilden Sie Φ3 mm Achse Löcher an jeder der vier Ecken der beiden Aluminiumplatten.
5. Genießen Sie die Aluminiumplatten in 15 % Schwefelsäure für 12 h zu ihren Oberflächen zu reinigen. Da die dünne Schicht aus Aluminiumoxid auf die Oberfläche des Aluminiums machen es korrosionsbeständig, werden der Lochdurchmesser und der Dicke der Platte durch diese Säurebehandlung nicht geändert.
6. Bilden Sie eine 30 × 30 Array von 1 x 1 x 1 mm-Neodym-Magneten (mit einer Magnetfeldstärke von 0.363 N). Sicherstellen Sie, dass jeder Magnet entgegengesetzter Polarität zu seinen Nachbarn. Zur Vermeidung von Bruch oder Streuung des Arrays Magnet befestigen Sie eine 30 x 30 mm Alu-Platte an der Unterseite des Magnet-Arrays mit doppelseitigem Klebeband (Abb. 2a, Iii und Einschub in Abbildung 2).

(2) Perle Trapping Prozess

1. Ausrichten und Stapeln zwei Aluminiumplatten (top-Platte: 750-µm-Lochscheibe, Bodenplatte: 550-µm-Lochplatte) mit den vorbereiteten Ausrichtung Löcher an den vier Ecken der jede Platte (Abbildung 1 b).
2. Sperren Sie die beiden Platten zusammen durch Einfügen von M3 Schrauben in die Löcher der Ausrichtung, und befestigen Sie die Schrauben mit Muttern (Abbildung 1 b).
3. Stapeln Sie die Aluminium Platte Versammlung auf dem vorbereiteten Magnet-Array (Abbildung 1 b, 2 bund 2 c). Das Array von Magneten und das Array von Durchgangsbohrungen in die Aluminiumplatte während des stacking-Prozesses ausrichten. Verwenden Sie ein Klebeband, um die Position des Magneten Arrays zu fixieren.
4. Ort, eine ausreichende Anzahl von Φ600 mm SUJ2 Stahl Perlen auf der Platte-Versammlung und manipulieren die Perlen mit einem Acryl (oder nicht-metallischen) Platte so, dass eine Perle in jedes Loch (Abbildung 1 c, 1Dund 1e) während gleichzeitig gefangen wird Entfernen der überschüssigen Perlen, die nicht in die Löcher gestellt haben.
5. Entfernen Sie vorsichtig die obere Platte zur Vermeidung unerwünschter Streuung und Dislokation der eingeschlossenen Perlen (Abb. 1f).

(3) konkav Microwell-Fertigung

1. Verschieben Sie die konkave Microwell Form, produziert in Schritte 2.1 bis 2.5, oben auf einer Petrischale.
2. Polydimethylsiloxan (PDMS) Monomer und Härtemittel gemäß des Herstellers Anweisungen¹⁹ mit einem PDMS-Monomer mischen: Heilung von Agent-Verhältnis von 10:1.
3. De-Gas die PDMS-Mischung mit einem Exsikkator und Vakuumpumpe, um gefangen in der PDMS-Mischung Bläschen zu entfernen.
4. Die PDMS Mischung in die konkave Microwell-Form und de-Gas wieder mit dem gleichen Verfahren wie in 3.3 (Abb. 1f) beschrieben.
5. Backen Sie die PDMS-Mischung auf einer Herdplatte bei 80 ° C für 2 h um eine Perle eingebettet PDMS Substrat (Abbildung 1 g) zu bilden.
6. Entfernen Sie das ausgehärtete PDMS-Substrat aus der Form (Abbildung 1 g). Sprühen Sie entfernen dabei Methanol mit waschen Flasche PDMS Substrat aus der Form lösen.
7. Mit einem Φ15 mm x 2 mm Magnet eingeschlossenen Stahlkügelchen von PDMS-Substrat (Abbildung 1 h) entfernen. Dabei kann jeder Magnet, die ausreichend stark, extrahieren Sie die Perlen aus dem PDMS-Substrat verwendet werden.

4. Sphäroid Kultur

1. Schneiden Sie das konkave Microwell-gemusterten PDMS Substrat mithilfe einen Φ14-mm-Biopsie-Punch in 24-Well-Platte in dieser Studie eingesetzt werden.
2. Das daraus resultierende Φ14 mm PDMS Substrat in einem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C und 15 Psi zu sterilisieren.
3. Legen Sie die sterilisierte PDMS-Substrat in einer 24-well-Platte.
4. Bestreichen Sie das gesamte PDMS-Substrat mit 4 % (w/V) Pluronic F-127 Lösung über Nacht Zellhaftung an die Microwell-Oberfläche zu verhindern. Während des Beschichtungsprozesses entfernen Sie Luftblasen eingeschlossen in der konkaven Mikrovertiefungen durch Pipettieren oder mithilfe eines Ultraschall-Reinigers.
5. Spülen Sie die F-127-Lösung dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
6. Samen Sie 1 mL der Lösung (enthält 2 x 10⁶ Zellen) Zelle-Medium (Dulbeccos geändert Eagle Medium) auf dem PDMS-Substrat. Beachten Sie, dass die Aussaatdichte je nach Zielgröße Sphäroid und/oder Ziel-Handy-Typ geändert werden kann. Hier wurden Fettgewebe Stammzellen (ASC) verwendet.
7. Aspirieren Sie 1 mL des Mediums mit einer 1000 µL Pipette, entfernen alle überschüssigen Zellen, die nicht gefangen wurden in Mikrovertiefungen (Abbildung 3).
8. Inkubation der Zellen bei 36,5 ° C, Luftfeuchtigkeit von > 95 % und 5 % CO₂ Zustand. Im Falle der ASC in unserer Studie verwendeten aggregieren die Zellen auf ein Sphäroid in 48 h.

Ergebnisse

Eine konvexe Form und Microwell Muster wurden erfolgreich von folgenden Schritte 2.1 bis 3.7 hergestellt. (Abbildung 4). Die kommerzielle Stahlkügelchen wurden in 30 x 30 Durchgangsbohrung Array gefangen. Die Perlen waren dicht ohne Lücken zwischen den Perlen und den entsprechenden Durchgangsbohrungen (Abb. 4a) statt. Die Form des vorgefertigten konkave Microwell ist konkav halbkugelförmigen, mit einem Durchmesser von 600 µm,...

Diskussion

Die größte Herausforderung für dieses Herstellungsverfahren wurde die sichere Befestigung der Perlen in der Durchgangsbohrung-Array in der Aluminiumplatte. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurde Magnetkraft in Form eines Arrays von 30 x 30 Magnet verwendet, um die Perlen fest, wie in Abbildung 6 und 7zu beheben. Die magnetische Flussdichte des Magnet-Arrays, die entgegengesetzten Polarität hat, ist am stärksten in der Mitte der einzelnen Magnetoberfläche. Da die Stärke der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011