חרוז לזווג עם מגנט במערך צורניים Microwells עם משתנה גיאומטריות קעורה

Summary

כתב יד זה מציג שיטה חזקה של בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. באמצעות כוח מגנטי, חרוזים פלדה מערך דרך חור, מספר מאות microwells נוצרו במצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ.

Abstract

תרבות ספרואיד הוא כלי שימושי להבנת התנהגות הסלולר בכך שהוא מספק של ויוו-כמו סביבה תלת-ממדי. שיטות הייצור ספרואיד שונים כגון משטחים ללא דבק, טווה מבחנות, טיפות באוויר, microwells השתמשו במחקרים של אינטראקציה לתא, ההפעלה החיסונית, סמים הקרנה, גזע תאית התמיינות, ויצירת תא צורב. בין השיטות, microwells עם גאומטריה קעורה תלת מימדי השיגו את תשומת הלב של מדענים ומהנדסים, בהתחשב יתרונם של דור ספרואיד בגודל אחיד ואת הקלות שבה ניתן התגובות של spheroids בודדים פיקוח. אף-על-פי שיטות חסכוניים כגון השימוש של ממברנות גמיש, ליתוגרפיה קרח הוצעו, טכניקות אלו כרוכות חסרונות רציניים כגון קושי בשליטה על גודל התבנית, ההישג של יחסי גודל גבוהה והייצור של אזורים גדולים של microwells. כדי להתגבר על בעיות אלה, אנו מציעים שיטה חזקה בדיית קעורה microwells ללא צורך מתחם מתקני עלות גבוהה. שיטה זו משתמשת מערך דרך חור 30 x 30, פלדה מיקרומטר מאה-הזמנה מספר חרוזים, כוח מגנטי כדי לבדות 900 microwells על מצע polydimethylsiloxane (PDMS) 3 ס"מ על 3 ס"מ. כדי להדגים את הישימות של השיטה שלנו ליישומים ביולוגית התא, אנחנו תרבותי תאי גזע אדיפוז 3 ימים והפיק בהצלחה spheroids באמצעות הפלטפורמה שלנו microwell. בנוסף, נוכל לבצע סימולציה magnetostatic לחקור את המנגנון, לפיה כוח מגנטי שימש כדי ללכוד את החרוזים פלדה החורים דרך. אנו מאמינים כי שיטת ייצור microwell המוצע יכול להיות מיושם מבוססי ספרואיד הסלולר מחקרים רבים כגון והתרופות הקרנה, התחדשות רקמות, התמיינות תאי סרטן גרורות.

Introduction

התאים גדלו לתוך טופס ספרואיד דומים יותר אמיתי רקמות בגוף מאשר תרבות מישורי דו-ממדי¹. בהתחשב יתרון זה, השימוש spheroids אומץ כדי לשפר את המחקר של אינטראקציה לתא^2,3, ההפעלה החיסונית⁴, סמים הקרנת⁵וכן בידול⁶. בנוסף, spheroids שילוב סוגי תאים מרובים לאחרונה הוחלו על organoids (ליד-פיזיולוגיים תלת מימדי (3D) רקמות), אשר מאוד שימושי עבור לימוד ופיתוח המחלה האנושית⁷. מספר שיטות השתמשו כדי לייצר spheroids. השיטה הפשוטה ביותר כרוך הניצול של משטח ללא דבק, כך התאים צבירה עם כל טופס spheroids. צלחת פטרי יכולים להיות מטופלים עם אלבומין שור, pluronic F-127 או פולימר הידרופובי (למשל פולי 2-hydroxyethl methacrylate) כדי להפוך את השטח ללא דבק⁸⁹. השיטה ספינר-הבקבוק הוא אמצעים ידועים אחרים לייצר כמויות גדולות של spheroids^10,11. בשיטה זו, תאים מוחזקים השעיה על-ידי ערבוב כדי למנוע מהם להפוך למצע. במקום זאת, הצפים תאים צבירה כדי טופס spheroids. שיטת משטח ללא דבק והן טווה את הבקבוק שיטה לייצר כמויות גדולות של spheroids. עם זאת, הם כפופים למגבלות לרבות קשיים שליטה בגודל ספרואיד, כמו גם את המעקב וניטור של כל ספרואיד. כתרופה בעיות כאלה, שיטה אחרת ספרואיד הייצור, כלומר, התליה זרוק שיטה יכול להיות מועסקים¹². פעולה זו כרוכה הפקדת תא טיפות השעיה על החלק התחתון של המכסה לצלחת תרבות. טיפות אלה הם בדרך כלל 15 אל 30 µL בגודל ומכילים כ 300 עד 3000 תאים¹³. כאשר המכסה היא הפוכה, הטיפות מתקיימים במקום על ידי מתח. הסביבה microgravity כל טיפה מרכזת את התאים, המהווים ואז spheroids יחיד-הממשק נוזלי-אוויר חופשי. היתרונות של התליה טיפה שיטה הם שהיא מציעה התפלגות גודל ומבוקרות היטב, בעוד קל לאתר ולעקוב אחר כל ספרואיד, יחסית ללא דבק השטח, טווה את הבקבוק השיטות. עם זאת, שיטה זו כרוך חיסרון אחד בייצור מאסיבי של spheroids תהליך הייצור עצמה היא מוגזמת עבודה אינטנסיבית.

מערך microwell הוא שטוח צלחת עם בארות רבות בגודל מיקרו, שלכל אחד מהם בקוטר הנע בין 100 מיקרומטר 1000. העיקרון ייצור ספרואיד בעת שימוש microwells דומה לזה של שיטת משטח ללא דבק. היתרונות כוללים את העובדה כי microwells לספק רווחים בין microwells להפריד את התאים או spheroids, כך קל לשלוט על גודל ספרואיד, תוך כדי גם מה שהופך אותו קל לעקוב אחר כל ספרואיד יחיד. עם מספר גדול של microwells, ייצור תפוקה גבוהה ספרואיד אפשרי גם כן. יתרון נוסף של microwells הוא האפשרות טופס בארות של צורות שונות (מסגרות, גלילי, הטריגונלית מנסרתיים) בהתאם למטרות ניסוי ייחודי של המשתמשים. בדרך כלל, עם זאת, תלת מימדי (3D) קעורה (או המיספרי) צורה כמטוס המתאימים ביותר להפקת spheroids יחיד בגודל אחיד. לכן, התועלת של microwells קעורה דווחה ללימודי ביולוגיה תא רבים כגון אלה לבחון את הבידול cardiomyocyte של תאי גזע עובריים¹⁴, הפרשת אינסולין תא איון אשכולות¹⁵, פעילות אנזימטי של hepatocytes¹⁶, וההתנגדות סמים של גידול spheroids¹⁷.

לצערי, הזיוף של microwells לעיתים קרובות דורשת מתקנים מיוחדים micropatterning; שיטות קונבנציונליות מבוססי פוטוליתוגרפיה דורשות חשיפה ומתקני המתפתח בעוד שיטות המבוססות על יון-איכול תגובתי צריך ציוד פלזמה ויון-קרן. ציוד כזה הוא יקר, יחד עם תהליך ייצור מורכב, שמציג מחסום כניסה גבוה לביולוגים שאין להם גישה מיקרוטכנולוגיה. כדי להתגבר על בעיות אלה, חסכונית בשיטות אחרות כגון קרח ליתוגרפיה¹⁸ (באמצעות טיפות מים קפואים), שיטת הממברנה הגמישה¹⁴ (באמצעות קרום, דרך חור המצע ואקום) שהוצעו. עם זאת, שיטות אלה כרוכים גם החסרונות רציני כמו שזה היה קשה לשלוט את גודל דוגמת המילוי, הפרי של יחסי גודל גבוה, ואת הייצור של אזור גדול יותר microwells.

כדי להתגבר על הבעיות הנ ל, מה שאנו מציעים שיטת ייצור חדשניים microwell קעורה ניצול מצע דרך חור פלדה חרוזים, מערך מגנט. באמצעות שיטה זו, מאות קעורה microwells כדורית יכול להיות מפוברק על ידי ניצול של המנגנון של מגנטי כוח-בסיוע עצמית נעילה מתכתי חרוזים (איור 1). תהליך ייצור כרוכה בשימוש במתקני מעט מאוד יקר ומסובך, אינה דורשת מיומנויות מתקדמות רבות. ככזה, אנשים אפילו מיומנים יכולים בקלות מתחייבים בשיטה זו פבריקציה נוספת. כדי להדגים את השיטה המוצעת, נגזר על האדם-שומן בתאי גזע היו תרבותי ב microwells קעורה כדי לייצר spheroids.

Protocol

1. הכנת מערך דרך חור אלומיניום פלייט, מגנט מערך

1. להכין שני 50 מ"מ x 50 מ"מ (או גדול) פלטות אלומיניום. העובי של כל צלחת היה מיקרומטר 300 זה ממחצית הקוטר חרוז.
2. טופס מערך דרך חור 30 x 30 על אחד הלוחות אלומיניום באמצעות חרט סיבוביים CNC עם Φ550-מיקרומטר מיקרו מקדחה עם 30 מ מ/s של 8000 סל"ד של פלך מהירות וקצב מים עמוקים. המרחק בין כל חור (מרכז למרכז) היה 1 מ מ (איור 1a ו- איור 2a, אני).
3. טופס מערך 30 x 30 מיקרומטר Φ750 דרך חורים על אחרים הצלחת אלומיניום, באמצעות ההליך אותו כמו זה שמתואר 1.2 (איור 1a , איור 2a, ii).
4. לצרף שתי צלחות אחד את השני באמצעות סרט דביק ויוצרים Φ3 מ"מ יישור חורים בכל אחד בארבע הפינות של שתי פלטות אלומיניום.
5. לטבול הלוחות אלומיניום 15% חומצה גופרתית במשך 12 שעות לניקוי משטחים שלהם. מאז שכבה דקה של אלומיניום אוקסיד על פני השטח של האלומיניום להפוך עמידים בפני קורוזיה, קוטר חור ואת עובי הלוח אינם משתנים על ידי טיפול החומצה הזו.
6. טופס מערך 30 × 30 1 x 1 x 1 מ מ נאודימיום מגנטים (עם כוח מגנטי של 0.363 N). ודא כי כל מגנט הקוטביות הפוכה לשכן שלו. כדי למנוע את שבירת או פיזור של המערך מגנט, לצרף צלחת 30 x 30 מ מ אלומיניום התחתון של המערך מגנט באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי (איור 2 א, השלישי, שיבוץ ב איור 2).

2. חרוז השמנה תהליך

1. ליישר, לערום את שני לוחות אלומיניום (top צלחת: 750-מיקרומטר-חור צלחת, צלחת התחתון: 550-מיקרומטר-חור צלחת) באמצעות החורים יישור מוכן בארבע פינות של כל צלחת (איור 1b).
2. לנעול את שתי צלחות יחד על-ידי הוספת M3 ברגים לתוך החורים יישור ולאחר מכן לאבטח את המנעולים עם אגוזים (איור 1b).
3. מחסנית מכלול לוחית אלומיניום במערך מגנט מוכן (איור 1b, 2bו- 2 c). יישר את המערך של מגנטים, המערך של דרך חורים לוח אלומיניום במהלך תהליך הערימה. לאחר מכן להשתמש סרט דביק כדי לתקן את המיקום של המערך מגנט.
4. המקום מספר מספיק של Φ600 מ"מ SUJ2 פלדה חרוזים על מכלול צלחת ולטפל החרוזים באמצעות אקריל (או מתכתיים) צלחת כזו חרוז. הופך להיות לכוד בתוך כל חור (איור 1 ג, 1 דו 1e) בזמן בו זמנית הסרת את החרוזים עודף אשר לא הגישו החורים.
5. הסר בזהירות את הפלטה כדי למנוע פיזור לא רצויים פריקה של חרוזים לכודה (איור 1f).

3. קעורה microwell ייצור

1. להעביר כייר קעורה microwell, מיוצר בשלבים 2.1-2.5, לעיל, צלחת פטרי.
2. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) מונומר והסוכן ריפוי על-פי הוראות היצרן¹⁹ עם מונומר PDMS: אשפרה הסוכן יחס של 10:1.
3. גז מבטל את התערובת PDMS באמצעות desiccator וחדר משאבת ואקום כדי להסיר את כל הבועות לכוד בתוך התערובת PDMS.
4. שופכים את התערובת PDMS לתבנית microwell קעורה וגז והתבקשתי שוב באמצעות אותו הנוהל כמו זה שמתואר 3.3 (איור 1f).
5. אופים את התערובת PDMS על גזייה ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ליצור מצע PDMS חרוז-מוטבע (איור 1 g).
6. הסר את המצע PDMS נרפא התבנית (איור 1 g). בתהליך הסרת, תרסיס מתנול באמצעות בקבוק כביסה כדי לנתק PDMS המצע של העובש.
7. שימוש של Φ15 מ מ x 2 מ מ מגנט, הסר את החרוזים פלדה לכוד המצע PDMS (איור 1 h). במשך תהליך זה, כל מגנט חזקה דיה כדי לחלץ את החרוזים של המצע PDMS יכול לשמש.

4. ספרואיד תרבות

1. חותכים המצע PDMS קעורה בדוגמת microwell באמצעות אגרוף ביופסיה מ מ Φ14 כדי להיות מצויד בצלחת 24-ובכן במחקר זה.
2. לעקר את המצע PDMS מ"מ Φ14 שנוצר במעקר אוטוקלב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.
3. מקם את המצע PDMS סטיריליים לצלחת 24. טוב.
4. מעיל המצע PDMS שלם עם 4% (w/v) pluronic F-127 פתרון בן לילה כדי למנוע התא מצורף אל פני השטח microwell. במהלך תהליך ציפוי, להסיר את כל בועות האוויר בפח של microwells קעורה באמצעות pipetting או באמצעות שימוש של ניקוי אולטראסוניות.
5. לרוקן את הפתרון F-127 שלוש פעמים על-ידי שימוש באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
6. זרע 1 מ"ל של התא-בינוני (של Dulbecco ששינה נשר בינוני) פתרון (המכיל 2 x 10⁶ תאים) על המצע PDMS. שימו לב כי ניתן לשנות את צפיפות זריעה לפי גודל ספרואיד היעד ו/או סוג תא היעד. . הנה, נגזר שומן בתאי גזע (ASC) שימשו.
7. האחות של 1 מ"ל של מדיום באמצעות פיפטה µL של 1000 כדי להסיר תאים עודף זה לא נלכדו microwells (איור 3).
8. דגירה התאים ב- 36.5 ° C, לחות של > 95% ו- 5% CO₂ תנאי. במקרה של השיקופיים השתמשו במחקר שלנו, התאים צבירה כדי ספרואיד 48 שעות.

תוצאות

Microwell דפוס ולעצב קמורה זוייפו בהצלחה על-ידי ביצוע שלבים 2.1 ל 3.7. (איור 4). החרוזים פלדה מסחרי נלכדו במערך דרך חור 30 x 30. החרוזים התקיימו בחוזקה ללא פערים בין החרוזים המתאים דרך-החורים (איור 4a). צורת microwell קעורה מפוברק קעור המיספרי, בקוטר של 600 מיק?...

Discussion

האתגר של מרכזי בשיטה זו פבריקציה נוספת היה מתקן מאובטח של החרוזים במערך דרך חור בצלחת אלומיניום. כדי לפתור את האתגר הזה, כוח מגנטי בצורה של מערך מגנט 30 x 30 שימש כדי לתקן את החרוזים בצורה מאובטחת, כפי שמוצג דמויות 6 ו -7. צפיפות השטף המגנטי של המערך מגנט, הכולל את הקוטביות הפוכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011