Une perle apparié et aimant tableau pour le moulage des micropuits avec des géométries variables Concave

Résumé

Ce manuscrit présente une méthode robuste de fabrication micropuits concaves sans la nécessité d’installations complexes de desserte à coût élevé. En utilisant la force magnétique, billes en acier et un tableau d’à travers-trou, plusieurs centaines micropuits ont été formées dans un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) 3 cm x 3 cm.

Résumé

Une culture de sphéroïde est un outil utile pour comprendre le comportement cellulaire qu’il fournit un en vivo-comme l’environnement en trois dimensions. Diverses méthodes de production de sphéroïde tels que les surfaces non adhésive, flacons de spinner, pendaison gouttes et micropuits ont été utilisés dans l’étude de l’interaction cellule-cellule, activation immunitaire, drogue, dépistage, tige la différenciation cellulaire et organoïde génération. Parmi ces méthodes, micropuits avec une géométrie concave en trois dimensions ont retenu l’attention de scientifiques et d’ingénieurs, compte tenus de leurs avantages de génération sphéroïde de taille uniforme et la facilité avec laquelle les réponses des sphéroïdes individuels peuvent être surveillé. Même si les méthodes rentables telles que l’utilisation des membranes flexibles et lithographie de glace ont été proposés, ces techniques encourent de graves inconvénients comme la difficulté à contrôler la taille du modèle, réalisation des allongements élevés et la production de grandes zones de micropuits. Pour résoudre ces problèmes, nous vous proposons une méthode robuste de fabrication micropuits concaves sans la nécessité d’installations complexes de desserte à coût élevé. Cette méthode utilise un tableau d’à travers-trou de 30 x 30, en acier plusieurs centaines micromètre-ordre perles et force magnétique pour fabriquer 900 micropuits dans un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS) 3 cm x 3 cm. Afin de démontrer l’applicabilité de notre méthode pour applications biologiques cellulaires, nous mis en culture des cellules souches adipeuses pendant 3 jours et produit avec succès des sphéroïdes à l’aide de notre plateforme de microtitration. En outre, nous avons effectué une simulation de magnétostatique pour étudier le mécanisme, par lequel force magnétique a été utilisée pour piéger les billes en acier dans les trous. Nous croyons que le procédé de fabrication de microtitration proposé pouvait être appliquée à beaucoup d’études cellulaires axée sur le sphéroïde tels que le dépistage des drogues, la régénération tissulaire, différenciation des cellules souches et métastases cancéreuses.

Introduction

Les cellules cultivées dans une forme sphéroïde sont plus proches de tissu réel dans le corps à une culture plane à deux dimensions¹. Compte tenu de cet avantage, l’utilisation des sphéroïdes a été adoptée afin d’améliorer l’étude de l’interaction d’une cellule à^2,3, activation immunitaire⁴,⁵et⁶de la différenciation de dépistage de drogue. En outre, sphéroïdes intégrant plusieurs types de cellules ont récemment été appliquées à organoïdes (près-physiologique en trois dimensions (3D) de tissu), qui sont très utiles pour étudier le développement et la maladie humaine⁷. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour produire des sphéroïdes. La méthode la plus simple consiste à l’utilisation d’une surface non adhésive, telles que les cellules agrègent entre elles et sphéroïdes de forme. Une boîte de Pétri peuvent être traitées avec l’albumine sérique bovine, Pluronique F-127 ou un polymère hydrophobe (p. ex. le méthacrylate de 2-hydroxyethl poly) pour rendre sa surface non adhésive⁸⁹. La méthode spinner-ballon est un autre moyen connu de produire de grandes quantités de sphéroïdes^10,11. Dans cette méthode, cellules sont maintenues en suspension par agitation pour les empêcher de devenir attaché au substrat. Au lieu de cela, le flottement des cellules au total à sphéroïdes de forme. La méthode surface non adhésive et méthode du flacon toupie peuvent produire de grandes quantités des sphéroïdes. Cependant, ils sont sous réserve des limites, y compris les difficultés à contrôler la taille de sphéroïde, ainsi que le suivi et la surveillance de chaque sphéroïde. Comme un remède pour ce genre de problèmes, une autre méthode de production de sphéroïde, à savoir, la pendaison drop méthode peuvent être indépendants¹². Cela consiste à déposer des gouttes de suspension cellulaire sur le dessous du couvercle d’une boîte de Petri. Ces gouttes sont généralement 15 à 30 µL en taille et contient environ 300 à 3000 cellules¹³. Lorsque le couvercle est inversé, les gouttes sont maintenus en place par la tension superficielle. La microgravité dans chaque goutte concentre les cellules, qui forment alors des sphéroïdes unique à l’interface liquide-air libre. Les avantages de la pendaison méthode drop sont qu’elle offre une distribution de taille bien contrôlées, s’il est facile de retracer et de surveiller chaque ellipsoïde, par rapport à des méthodes de fiole non-adhésifs surface et le cône. Toutefois, cette méthode entraîne un inconvénient en ce que la production massive de sphéroïdes et le processus de production lui-même est excessivement labor intensive.

Un tableau de microtitration est un plat plaque avec nombreux puits de taille micro, chacun ayant un diamètre allant de 100 à 1000 µm. Le principe de production de sphéroïde lors de l’utilisation des puits est similaire à celle de la méthode de surface non adhésive. Avantages incluent le fait que micropuits offrent des espaces entre les puits pour séparer les cellules ou les sphéroïdes, tel qu’il est facile de contrôler la taille de sphéroïde, tout en la rendant aussi facile à contrôler chaque ellipsoïde simple. Avec un grand nombre de puits, production de sphéroïde de haut débit est également possible. Un autre avantage de micropuits est la possibilité de puits de forme des formes différentes (hexaèdres, cylindrique, trigonale prismatique) selon des fins expérimentales uniques des utilisateurs. En règle générale, cependant, une forme tridimensionnelle (3D) concave (ou hémisphérique) est considérée comme étant les plus aptes à la production de taille uniforme unique sphéroïdes. Par conséquent, l’utilité de micropuits concaves a été signalée dans plusieurs études de biologie cellulaire comme celles examinant la cardiomyocyte la différenciation de cellules souches embryonnaires¹⁴, la sécrétion d’insuline des cellules des îlots pancréatiques grappes¹⁵, la activité enzymatique des hépatocytes¹⁶et la résistance aux médicaments de tumeur sphéroïdes¹⁷.

Malheureusement, la fabrication de micropuits souvent exige que les installations spécialisées microstructuration ; les méthodes classiques axées sur la photolithographie nécessitent l’exposition et des installations en voie de développement tandis que réactives ion-eau-forte-méthodes basées sur le besoin d’équipement plasma et faisceau d’ions. Cet équipement est coûteux qui, ainsi que le processus de fabrication complexe, présente une haute barrière à l’entrée pour les biologistes qui n’ont pas accès aux microtechniques. Pour résoudre ces problèmes, autres méthodes rentables tels que glace Lithographie¹⁸ (en utilisant les gouttelettes d’eau congelée) et la membrane souple méthode¹⁴ (à l’aide d’une membrane, substrat d’à travers-trou et un vide) ont été suggérés. Toutefois, ces méthodes subissez également sérieux inconvénients tels que qu’il soit difficile de contrôler les tailles de patron, la réalisation des allongements élevés et la production de micropuits de plus grande surface.

Pour surmonter ces problèmes, nous vous proposons une méthode de fabrication nouveaux micropuits concave utilisant un substrat d’à travers-trou, billes en acier et un tableau magnétique. En utilisant cette méthode, des centaines de puits sphériques concaves peuvent être fabriquées en profitant du mécanisme de force magnétique-assistée autobloquants perles métalliques (Figure 1). Le procédé de fabrication implique l’utilisation de très peu d’installations coûteuses et compliquées et n’exige pas beaucoup de compétences avancées. Ainsi, des personnes même non qualifiées peuvent entreprendre facilement cette méthode de fabrication. Pour illustrer la méthode proposée, l’homme adipeux-dérivées de cellules souches ont été cultivées dans des micropuits concaves pour produire des sphéroïdes.

Protocole

1. préparation d’à travers-trou tableau aluminium plaque et aimant array

1. Préparer deux 50 mm x 50 mm (ou plus) plaques d’aluminium. L’épaisseur de chaque plaque a été 300 µm qui est la moitié du diamètre de la perle.
2. Forment un éventail d’à travers-trou de 30 x 30 sur une des plaques d’aluminium à l’aide d’un graveur rotatif CNC avec un peu de micro perceuse Φ550-µm avec 30 mm/s de taux de chute et 8000 tr/min de vitesse de broche. La distance entre chaque trou (Centre) était de 1 mm (Figure 1 et Figure 2 a, j’ai).
3. Former un tableau de 30 x 30 de Φ750-µm à travers-trous sur l’autre plaque en aluminium, en utilisant la même procédure que celle décrite en 1.2 (Figure 1 et Figure 2 a, ii).
4. Fixez les deux plaques entre eux à l’aide d’un ruban adhésif et forment des orifices d’alignement mm Φ3 à chacun des quatre coins des deux plaques d’aluminium.
5. Faire tremper les plaques en aluminium à 15 % d’acide sulfurique pendant 12 h nettoyer leurs surfaces. Étant donné que la fine couche d’oxyde d’aluminium sur la surface de l’aluminium le rend résistant à la corrosion, le diamètre du trou et l’épaisseur de la plaque ne sont pas modifiées par ce traitement à l’acide.
6. Former un tableau de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 aimants de néodyme de mm (avec une force magnétique de 0,363 N). Veiller à ce que chaque aimant est la polarité opposée à son voisin. Pour éviter la rupture ou la diffusion du tableau aimant, fixer une plaque d’aluminium de 30 x 30 mm au bas du tableau magnétique à l’aide de ruban double-face (Figure 2 a, iii et encart dans la Figure 2).

2. processus de piégeage perle

1. Aligner et empiler les deux plaques d’aluminium (plaque supérieure : 750-µm-trou de la plaque, la plaque inférieure : 550-µm-trou de la plaque) en utilisant les trous préparés alignement aux quatre coins de chaque plaque (Figure 1 b).
2. Verrouiller les deux plaques ensemble en insérant les boulons de M3 dans les trous de l’alignement et puis fixer les boulons et écrous (Figure 1 b).
3. Empiler l’assemblage de plaque d’aluminium sur le tableau préparé aimant (Figure 1 b, 2 bet 2C). Aligner le tableau des aimants et le tableau des trous dans la plaque d’aluminium au cours du processus d’empilage. Puis utilisez un ruban adhésif pour fixer la position du tableau magnétique.
4. Place un nombre suffisant de Φ600 mm SUJ2 acier perles sur la plaque et de manipuler les billes à l’aide d’un acrylique (ou non métalliques) plaque de tel qu’une perle se retrouve piégée dans chaque trou (Figure 1C, 1Det 1e) tout en même temps enlever les perles excès qui n’ont pas déposé dans les trous.
5. Retirer délicatement la plaque supérieure pour éviter la diffusion non désirée et dislocation des perles piégés (Figure 1f).

3. concave microwell fabrication

1. Déplacez le moule microwell concave, produit en étapes 2.1 à 2.5, ci-dessus, à une boîte de Pétri.
2. Mélanger le polydiméthylsiloxane (PDMS) monomère et salaison selon instructions^{19 les directives du fabricant} avec un monomère PDMS : ratio 10:1 agent de polymérisation.
3. Dé-gaz le mélange PDMS en utilisant un dessiccateur et pompe à vide pour enlever les bulles pris au piège dans le mélange PDMS.
4. Versez le mélange PDMS dans le moule de microtitration concave et dé-gaz à nouveau en utilisant la même procédure que celle décrite en 3.3 (Figure 1f).
5. Faites cuire le mélange PDMS sur une plaque de cuisson à 80 ° C pendant 2 h former un substrat PDMS perle incorporé (Figure 1 g).
6. Enlever le substrat PDMS guéri du moule (Figure 1 g). Dans le processus de suppression, vaporiser le méthanol à l’aide de bouteille de lavage pour détacher le substrat PDMS du moule.
7. À l’aide d’un Φ15 mm x 2 mm aimant, enlever les billes en acier pris au piège du substrat de PDMS (Figure 1 h). Pour ce processus, un aimant qui est suffisamment fort pour extraire les perles du substrat de PDMS peut être utilisé.

4. la culture de sphéroïde

1. Couper le substrat PDMS de microtitration à motifs concave à l’aide d’un poinçon de biopsie de mm Φ14 à être montés sur des plaques 24 puits dans cette étude.
2. Stériliser le substrat PDMS mm de Φ14 qui en résulte dans un stérilisateur autoclave à 121 ° C et 15 lb/po2.
3. Placez le substrat PDMS stérilisé dans une plaque 24 puits.
4. Enduisez le substrat PDMS ensemble avec 4 % (p/v) Pluronique F-127 solution du jour au lendemain pour empêcher la fixation des cellules à la surface de microtitration. Pendant le procédé de revêtement, éliminez les bulles d’air piégés dans les puits concaves en pipettant également, ou en utilisant un nettoyeur à ultrasons.
5. Rincer la solution F-127 trois fois à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
6. Graines de 1 mL de solution de cellule-milieu (Eagle modifié de Dulbecco milieu) (qui contient 2 x 10⁶ cellules) sur le substrat PDMS. Notez que la densité de semis peut être changée selon la cible sphéroïde taille et/ou le type de cellule cible. Ici, cellules souches dérivées d’adipeux (ASC) ont été utilisés.
7. Aspirer le 1 mL de milieu à l’aide d’une pipette de 1000 µL pour enlever toutes les cellules excédentaires qui n’étaient pas piégés dans les puits (Figure 3).
8. Incuber les cellules à 36,5 ° C, humidité de > 95 % et 5 % CO₂ condition. Dans le cas de l’ASCs utilisés dans notre étude, les cellules agrégées à un sphéroïde en 48 h.

Résultats

Un moule convexe et microwell modèle ont été fabriqués avec succès en suivant les étapes 2,1 à 3,7. (Figure 4). Les billes en acier commerciales ont été pris au piège dans le tableau d’à travers-trou de 30 x 30. Les perles ont été fermement maintenues sans aucun écart entre les perles et l’à travers-trous correspondants (Figure 4 a). La forme de préfabriqués microwell concave est concave hémisphérique, avec...

Discussion

Le défi majeur de cette méthode de fabrication a été la fixation sûre des perles dans le tableau d’à travers-trou dans la plaque d’aluminium. Pour résoudre ce défi, la force magnétique sous la forme d’un tableau de 30 x 30 aimant servait à fixer les perles solidement, comme illustré dans les Figures 6 et 7. La densité du flux magnétique du tableau aimant, qui a la polarité opposée, est la plus forte au centre de chaque surface de l’aimant. Parce que les effectifs d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011