Un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos

Resumen

Este manuscrito presenta un método robusto de la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Usando la fuerza magnética, granos de acero y una matriz a través del agujero, varios cientos los micropocillos fueron formados en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm.

Resumen

Un esferoide es una herramienta útil para comprender el comportamiento celular en que proporcione un en vivo-como el entorno tridimensional. Métodos de producción de varios esferoide como superficies no-adhesiva, frascos de spinner, gotas colgantes y micropocillos se han utilizado en estudios de interacción de célula a célula, activación inmune, de detección de drogas tallo diferenciación celular y la generación de organoide. Entre estos métodos, los micropocillos con una geometría cóncava tridimensional han ganado la atención de científicos e ingenieros, dados sus ventajas de generación esferoide de tamaño uniforme y la facilidad con que pueden ser las respuestas de los esferoides seguimiento. Aunque se han propuesto métodos rentables como el uso de membranas flexibles y litografía de hielo, estas técnicas incurren en graves inconvenientes como la dificultad para controlar el tamaño del patrón, logro de proporciones de alto y la producción de áreas más grandes de los micropocillos. Para superar estos problemas, proponemos un método robusto para la fabricación de los micropocillos cóncavos sin necesidad de instalaciones complejas de alto costo. Este método utiliza una matriz de 30 x 30 por-agujero, varios acero cien micrómetros-orden granos y la fuerza magnética para fabricar 900 micropocillos en un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) de 3 cm x 3 cm. Para demostrar la aplicabilidad de nuestro método para aplicaciones biológicas de la célula, se cultivan células madre adiposas para 3 días y producido con éxito utilizando nuestra plataforma de micropocillos de esferoides. Además, se realizó una simulación de magnetostática para investigar el mecanismo, por el que se utilizó fuerza magnética para atrapar los granos de acero en los agujeros. Creemos que el método de fabricación de micropocillos propuesto puede aplicarse a muchos estudios celulares basado en el esferoide como screening de drogas, regeneración de tejidos, diferenciación de la célula de vástago y metástasis del cáncer.

Introducción

Las células cultivadas en forma de esferoide son más similares a real tejido en el cuerpo de un plano bidimensional de la cultura¹. Teniendo en cuenta esta ventaja, el uso de esferoides se ha adoptado para mejorar el estudio de la interacción de célula a célula^2,3, activación inmune⁴,⁵y⁶de la diferenciación de la detección de drogas. Además, esferoides con múltiples tipos de células se han aplicado recientemente a organoides (cerca de-fisiológico tridimensional (3D) el tejido), que son muy útiles para estudiar el desarrollo y la enfermedad humana⁷. Varios métodos se han utilizado para producir esferoides. El método más simple consiste en la utilización de una superficie no adhesiva, que las células se agregan entre sí y esferoides de forma. Un plato de Petri pueden tratarse con albúmina de suero bovino, pluronic F-127 o un polímero hidrofóbico (por ejemplo metacrilato de 2-hydroxyethl de poly) para hacer su superficie no adhesiva⁸⁹. El método de frasco de spinner es otra forma bien conocida de producir grandes cantidades de esferoides^10,11. En este método, las células se llevan a cabo en suspensión agitando para evitar de ser unido al sustrato. Por el contrario, la flotación células agregado esferoides de forma. El método superficie no adhesiva y el método de frasco de spinner pueden producir grandes cantidades de esferoides. Sin embargo, están sujetas a limitaciones incluyendo dificultades en controlar el tamaño del esferoide, así como el seguimiento y monitoreo de cada esferoide. Como un remedio para este tipo de problemas, otro método de producción del esferoide, a saber, el colgante gota método pueden ser empleados¹². Se trata de depositar las gotas de la suspensión de células en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo. Estas gotas son generalmente 15 a 30 μL en tamaño y contienen aproximadamente de 300 a 3000 células¹³. Cuando se invierte la tapa, las gotas se llevan a cabo en lugar por la tensión superficial. El ambiente de microgravedad en cada gota concentra en las células, que entonces forman esferoides solo en la interfase líquido aire libre. Los beneficios de colgar el método de caída son que ofrece una distribución de tamaño bien controlados, si bien es fácil de rastrear y monitorear cada esferoide, en relación con los métodos de matraz superficie y spinner no adhesiva. Sin embargo, este método tiene una desventaja en que la producción masiva de esferoides y el propio proceso de producción es excesivamente trabajo intensivo.

Un conjunto de micropocillo es un plano de la placa con muchos pozos de tamaño micro, cada uno con un diámetro que van desde 100 hasta 1000 μm. El principio de producción del esferoide cuando utilice micropocillos es similar a la del método de superficie no adhesiva. Los beneficios incluyen el hecho de que los micropocillos proporcionan espacios entre los micropocillos para separar las células o esferoides, que es fácil controlar el tamaño del esferoide, mientras que también hace fácil supervisar cada esferoide sola. Con un gran número de los micropocillos, producción de esferoide alto rendimiento también es posible. Otra ventaja de los micropocillos es la opción a los pozos de la forma de diferentes formas (hexaedros, cilíndricos, trigonal prismático) dependiendo de propósitos experimentales únicas de los usuarios. En general, sin embargo, una forma tridimensional (3D) de cóncavo (o hemisférica) se considera el más adecuado para la producción de esferoides solo tamaño uniforme. Por lo tanto, la utilidad de los micropocillos cóncavos se ha divulgado para muchos estudios de Biología de la célula tales como examinar la diferenciación de cardiomiocitos de células madre embrionarias de¹⁴,¹⁵, racimos de la secreción de insulina de la célula del islote la actividad enzimática de los hepatocitos¹⁶y la resistencia a los medicamentos de tumor esferoides¹⁷.

Desafortunadamente, la fabricación de los micropocillos a menudo requiere instalaciones especializadas micropatterning; métodos de fotolitografía convencionales requieren exposición e instalaciones en vías de desarrollo mientras que los reactivos ion-aguafuerte-métodos necesitan equipo de plasma y viga de ion. Ese equipo es costoso que, junto con el proceso de fabricación complicado, presenta una alta barrera de entrada para los biólogos que no tienen acceso a la microtecnología. Para superar estos problemas, otros métodos rentables como hielo litografía¹⁸ (usando las gotas de agua congeladas) y el método de membrana flexible¹⁴ (usando una membrana, sustrato por-agujero y un vacío) se han sugerido. Sin embargo, estos métodos también conllevan graves inconvenientes como que es difícil controlar el tamaño del patrón, el logro de altos cocientes de aspecto y la producción de micropocillos de área más grande.

Para superar estas cuestiones, proponemos un método de fabricación de novela micropocillos cóncavo utilizando un substrato a través del agujero, bolas de acero y una variedad de imán. Usando este método, se pueden fabricar cientos de micropocillos esféricos cóncavos aprovechando el mecanismo de cuentas metálicas autobloqueantes asistida de fuerza magnética (figura 1). El proceso de fabricación implica el uso de muy pocas instalaciones costosas y complicadas y no requiere de muchas habilidades avanzadas. Como tal, personas aún pueden realizar fácilmente este método de fabricación. Para demostrar el método propuesto, humanos-adiposo-derivados de las células madre fueron cultivadas en los micropocillos cóncavos para producir esferoides.

Protocolo

1. elaboración de matriz de imán y placa de aluminio por-agujero matriz

1. Preparar dos de 50 x 50 mm (o mayor) placas de aluminio. El espesor de cada placa fue 300 μm que es la mitad del diámetro del grano.
2. Forman una matriz de 30 x 30 a través del agujero en una de las placas de aluminio utilizando un CNC grabador rotatorio con una Φ550-μm micro broca de 30 mm/s de tasa de penetración y 8000 RPM de velocidad del huso. La distancia entre cada agujero (de centro a centro) fue de 1 mm (Figura 1a y Figura 2a, ).
3. Formar una matriz de 30 x 30 de Φ750 μm a través de agujeros en la otra placa de aluminio, utilizando el mismo procedimiento que se describe en 1.2 (Figura 1a y Figura 2a, ii).
4. Coloque las dos placas entre sí utilizando una cinta adhesiva y formar los agujeros de alineación de Φ3 mm en cada una de las cuatro esquinas de dos placas de aluminio.
5. Remojar las placas de aluminio en ácido sulfúrico de 15% durante 12 h para limpiar sus superficies. Ya que la fina capa de óxido de aluminio sobre la superficie del aluminio que sea resistente a la corrosión, el diámetro de agujero y el grosor de la placa no cambia este tratamiento con ácido.
6. Forman una matriz de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 mm neodimio imanes (con una fuerza magnética de 0.363 N). Asegúrese de que cada imán es la polaridad opuesta a su vecino. Para evitar la ruptura o la dispersión de la matriz de imán, fije una placa de aluminio de 30 x 30 mm en la parte inferior de la matriz de imán usando cinta de doble cara (Figura 2a, la iii y la inserción en figura 2).

2. proceso de captura de grano

1. Alinear y apilar las dos placas de aluminio (top placa: placa de orificio de 750 μm, placa inferior: placa de orificio de 550 μm) usando los orificios de alineación dispuestos en las cuatro esquinas de cada placa (Figura 1b).
2. Traben las dos placas mediante la inserción de los tornillos M3 en los agujeros de alineación y luego fije los tornillos con tuercas (Figura 1b).
3. Coloque el ensamblaje de placa de aluminio en el arreglo de imán preparado (Figura 1b, 2by 2C). Alinee el conjunto de imanes y la matriz de agujeros en la placa de aluminio durante el proceso de apilado. Utilizar una cinta adhesiva para fijar la posición de la matriz de imán.
4. Lugar un número suficiente de acero de Φ600 mm. SUJ2 granos en el conjunto de placa y manipular los granos con un acrílico (o no metálico) de la placa tal que un grano queda atrapado en cada orificio (figura 1C, 1Dy 1e) mientras que al mismo tiempo quitar el exceso granos que no han presentado en los agujeros.
5. Retire con cuidado la placa superior para evitar la dispersión no deseada y la dislocación de los granos atrapados (figura 1f).

3. cóncavo micropocillos fabricación

1. Mover el molde cóncavo micropocillos, producido en pasos 2.1 a 2.5, arriba, a una placa Petri.
2. La mezcla de monómero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente endurecedor según las instrucciones de los fabricantes¹⁹ con un monómero PDMS: cociente de 10:1 del agente de curado.
3. Gas de la mezcla PDMS utilizando un desecador y una bomba de vacío para eliminar las posibles burbujas en la mezcla PDMS.
4. Vierta la mezcla PDMS en el molde cóncavo micropocillos y gas de nuevo utilizando el mismo procedimiento que se describe en 3.3 (figura 1f).
5. Cueza al horno la mezcla PDMS en la placa caliente a 80 ° C por 2 h para formar un sustrato PDMS integrado de grano (figura 1 g).
6. Quite el sustrato PDMS curado del molde (figura 1 g). En el proceso de extracción, pulverización metanol con botella de lavado para separar el sustrato PDMS del molde.
7. Con un Φ15 x imán de 2 mm, retire los granos de acero atrapados el sustrato PDMS (figura 1 h). Para este proceso, puede utilizarse cualquier imán que es suficientemente fuerte para extraer los granos del substrato de PDMS.

4. cultura de esferoide

1. Corte cóncavo sustrato PDMS micropocillos-patrón utilizando un punzón de biopsia Φ14 mm para montarse en placa de 24 pozos en este estudio.
2. Esterilizar el sustrato resultante de PDMS de mm Φ14 en un esterilizador de la autoclave a 121 ° C y 15 psi.
3. Coloque el sustrato esterilizado de PDMS en una placa bien 24.
4. La capa del sustrato PDMS todo con pluronic F-127 solución al 4% (w/v) durante la noche para evitar la fijación de células a la superficie de los micropocillos. Durante el proceso de capa, eliminar posibles burbujas de aire atrapadas en los micropocillos cóncavos mediante pipeteo o utilizando un limpiador ultrasónico.
5. Descargue la solución de F-127 tres veces mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
6. Sembrar 1 mL de solución de medio celular (medio de Eagle modificado de Dulbecco) (que contiene 2 x 10⁶ células) en el sustrato PDMS. Tenga en cuenta que la densidad de siembra puede cambiar según el tamaño del esferoide de destino o tipo de celda de destino. Aquí, se utilizaron células madre procedentes de adiposo (ASC).
7. Aspirar 1 mL del medio usando una pipeta de 1000 μL para quitar cualquier exceso células que no fueron atrapadas en los pocillos (figura 3).
8. Incubar las células en 36,5 ° C, humedad de > 95% y 5% CO₂ condición. En el caso de la ASC en nuestro estudio, las células se agregan a un esferoide en 48 h.

Resultados

Un molde convexo y un patrón de micropocillos fueron fabricados con éxito siguiendo los pasos 2.1 a 3.7. (Figura 4). Los granos de acero comerciales quedaron atrapados en la matriz por-agujero de 30 x 30. Los granos se mantuvieron firmemente sin espacios entre los granos y los correspondientes agujeros (figura 4a). La forma de micropocillos cóncava fabricado es cóncavo semiesférico, con un diámetro de 600 μm, que es lo mis...

Discusión

El reto principal de este método de fabricación era la segura fijación de los granos de la matriz a través del agujero en la placa de aluminio. Para resolver este desafío, la fuerza magnética en la forma de una matriz de 30 x 30 imán fue utilizada para fijar los granos con seguridad, como se muestra en las figuras 6 y 7. La densidad de flujo magnético de la matriz de imán, que tiene la polaridad opuesta, es más fuerte en el centro de cada superficie del imán. Porque la fuerza ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011