用于神经生长因子包封的新型HDL模拟纳米颗粒的制备和表征

摘要

使用简单的均质化来制备新颖的高密度脂蛋白模拟纳米颗粒以包封神经生长因子。本文描述了纳米颗粒制备， 体外表征和体内研究的挑战，详细方案。

摘要

本文的目的是介绍神经生长因子（NGF），高密度脂蛋白（HDL） - 纳米颗粒（NPs）的制备和表征方法。高密度脂蛋白是内源性NPs，已被探索作为递送治疗剂的载体。已经开发了各种制备HDL模拟NP的方法。然而，它们通常是复杂的，耗时的，而且对于工业规模来说是困难的。在本研究中，使用一步均质化来混合赋形剂并形成原型NP。 NGF是26kDa的水溶性蛋白质。为了便于将NGF包封到HDL模拟NP的脂质环境中，使用鱼精蛋白USP与NGF形成离子对复合物以中和NGF表面上的电荷。然后将NGF /鱼精蛋白复合物引入原型NP。载脂蛋白AI最终涂在NP的表面上。 NGF HDL模拟NP在术语上显示出优选的性质的粒径，粒度分布，包埋效率， 体外释放，生物活性和生物分布。通过仔细设计和探索高密度脂蛋白模拟NPs的均质化，程序大大简化，NPs可扩展。此外，克服了诸如从NP中分离未负载的NGF，进行可靠的体外释放研究和测量NP的生物活性的各种挑战。

引言

大分子如蛋白质，肽和核酸已经成为有希望的药物，并在过去几十年中获得了相当大的关注。由于其高效和特异的作用方式，它们对治疗癌症，免疫疾病，艾滋病毒及相关病症^3，4表现出很大的治疗潜力。然而，物理化学性质如其分子大小，三维结构，表面电荷和亲水性质使得这些大分子的体内递送非常具有挑战性。这大大阻碍了他们的临床应用。药物递送系统如微粒，聚合物纳米颗粒（NP），脂质体和脂质NPs的最新进展克服了这些挑战，并显着地改善了大分子的体内递送。何wever，已经揭示了这些运送货物的一些缺点，包括低的药物负载能力，低的包埋效率，短的半衰期，生物活性的丧失和不良的副作用5,6,7,8。有效的运营商系统仍然是研究兴趣领域。此外，开发用于表征药物负载NP的分析方法对于大分子而言比对小分子更具挑战性。

高密度脂蛋白（HDL）是由脂质核心组成的天然NP，其由载脂蛋白和磷脂单层包被。内源性HDL通过与目标受体（如SR-BI，ABCAI和ABCG1）的相互作用在脂质，蛋白质和核酸的转运中起关键作用。已经被探索作为递送不同治疗剂的载体⁹， ^10,11,12 。已经开发了各种制备HDL模拟NP的方法。透析是一种受欢迎的方法。在该方法中，通过使用胆酸钠溶液水合脂质膜来形成NP。然后通过用三个缓冲液¹³进行2天透析除去盐。超声处理方法通过在加热条件下超声处理脂质混合物60分钟制备NP;通过凝胶色谱法¹⁴进一步纯化NP。微流体通过微流体装置产生NP，其通过在聚焦模式¹⁵中产生微量涡来混合磷脂和载脂蛋白AI（Apo AI）溶液。显然，这些方法对于工业规模来说可能是耗时，苛刻和困难的。

在本文中，我们介绍了新型HDL模拟NPs神经的制备和表征生长因子（NGF）封装。 NGF是含有两个13.6-kDa多肽单体的二硫键连接的多肽同源二聚体。开发了通过均质化制备NPs的新方法，随后将NGF包被到NP中。 NGF HDL模拟NPs的特征在于粒度，大小分布，ζ电位和体外释放。对PC12细胞中的神经突生长评估了其生物活性。将NGF HDL模拟NPs的生物分布与静脉注射后的游离NGF的生物分布进行比较。

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研究方案

注意:所有程序中包含的动物研究已获得北德州健康科学中心大学机构动物护理和使用委员会的批准。

NGF HDL模拟纳米颗粒的制备

1. 在乙醇中溶解赋形剂，磷脂酰胆碱（PC），鞘磷脂（SM），磷脂酰丝氨酸（PS），胆固醇油酸酯（CO）和D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）），以制备1mg / mL的储备溶液。
   注意:将储备溶液等分并储存在-20°C。将胆甾醇油酸酯储存在黑暗的瓶子中。 PC，SM，PS和CO储备溶液在-20℃下分别稳定高达6,3,12和12个月。 TPGS溶液在-20℃下稳定至少12个月。
2. 将10μLNGF（1mg / mL水溶液）与10μL鱼精蛋白USP（1mg / mL水溶液）在1.5mL微量离心管中混合，并在室温下放置10分钟形成复合体。
   注意:将NGF和鱼精蛋白储备溶液等分并储存在-20℃。对NGF原料不推荐重复冻融。
3. 向玻璃瓶中加入59μLPC，11μLSM，4μLPS，15μLCO和45μLTPGS。在温和的氮气流下混合并蒸发乙醇约5分钟;所有赋形剂应在玻璃小瓶的底部形成油性薄膜。
4. 向小瓶中加入1mL超纯水（1型）水，并在室温下以9,500rpm（8,600×g）均化5分钟，形成原型NP。
5. 将步骤1.2中制备的复合物加入到原型NP中，并在玻璃小瓶中使用小的搅拌棒在37℃下搅拌孵育30分钟。
   1. 通过在室温下搅拌另外30分钟将NP降低。冷却后，加入106μLApo AI（1.49 mg / mL），室温搅拌过夜，形成最终NGF HDL模拟NP。

NGF HDL模拟纳米颗粒的表征

1. 根据制造商的说明书使用颗粒分析仪测量颗粒尺寸和ζ电位（参见材料表）。
2. 使用交联的琼脂糖凝胶过滤层析柱从NGF HDL模拟的NPs分离未负载的NGF并确定NGF的包埋效率。
   1. 对于柱制备，将15 mL Sepharose 4B-CL悬浮液转移到50 mL烧杯中。使用玻璃棒搅拌珠悬浮液，并将其倒入柱子（直径30厘米，直径1厘米，底部有玻璃料）。轻轻点击色谱柱以除去气泡。使溶剂排出，珠子沉降数分钟。
   2. 继续添加剩余的暂停。冲洗柱内壁清洁珠子。排出溶剂直到溶剂水平稍微a摆在固定相的顶部。用20mL 1x磷酸缓冲盐水（PBS，含有137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na ₂ HPO ₄和2mM KH ₂ PO ₄ ）洗涤并调节柱子。
   3. 为了确定含有未加载NGF的级分，将200μLNGF溶液（10μg/ mL）加到凝胶过滤柱（25cm长×1cm直径）上，并用1x PBS洗脱。
   4. 收集总共12个部分（每个部分1 mL），并使用三明治ELISA试剂盒测量NGF在每个级分中的浓度。
   5. 使用三明治ELISA试剂盒从6到10检测NGF。获取柱上未加载NGF的色谱图。用20 mL PBS洗柱。
   6. 为了确定含有NGF HDL-模拟NP的级分，将200μL的NP载入柱上，并用1x PBS洗脱。收集总共12个级分（每个级分1 mL），并测量每个级分u中的颗粒强度唱出粒度分析仪。从2级到4级检测NGF NP。
      注意:强度是由粒子分析仪测量的参数，它说明了测试溶液中可能存在多少纳米颗粒。溶液中存在的NP越多，强度越高。通过这种方法，我们可以确认该柱可以将NGF NP与未载入的NGF分离。
   7. 为了测量NGF的包埋效率，将200μLNGF HDL模拟的NP载入柱上，并用1x PBS洗脱。共收集12个级分（每个级分1 mL）。
   8. 使用三明治ELISA试剂盒测量未分级6至10的未加载NGF浓度。
   9. 将从部分6至10测量的NGF量作为未加载的NGF一起加入，并使用以下等式计算NGF的包载效率。
      ％EE =（1-未加载的NGF /加入NP中的总NGF）×100％等式（1）

3. 体外释放NGF HDL- 纳米微粒

1. 平行研究游离NGF（水中10μg/ mL; n = 4）和NGF HDL-模拟NP（10μg/ mL; n = 4）。
2. 按照制造商的说明预处理8个透析管（分子量截止值:300 kDa）。
3. 在PBS中制备5％牛血清白蛋白（BSA）作为释放培养基。将30 mL释放培养基加入到50 mL离心管中，并以135 rpm的振荡速度在振荡器中将其升温至37°C。将另外50 mL的释放介质置于振荡器中进行更换。
4. 将400μL释放培养基加入透析管，并快速加入200μL经过测试的样品，以制备足够的透析体积。
5. 关闭管子并迅速将透析管放入释放介质（离心管）中。从外部透析管中快速取出100μL的释放介质作为样品，时间为0.立即将样品置于-20°C进行后续分析。加入100μL新鲜的将介质放入离心管中以取代抽出的样品。启动计时器
6. 在1,2,4,6,8,24,48和72小时，取出100μL释放培养基，并用100μL新鲜培养基代替。立即将取出的样品放入-20°C进行后续分析。
7. 72小时后，将所有样品从-20°C取出，并在室温下解冻。使用三明治ELISA试剂盒测量释放样品的NGF浓度。

NGF HDL模拟纳米颗粒的生物活性（Neurite Outgrowth Study）

1. 在补充有10％热灭活马血清，5％胎牛血清，100μg/ mL链霉素和100单位/ mL青霉素的RPMI-1640培养基中培养PC12细胞。将细胞保持在37℃和5％CO ₂的潮湿培养箱中。
2. 当细胞达到〜70-80％汇合时，取出培养基，用1×PBS洗涤细胞（约10mL /sup> 2培养表面积）。取出洗液。通过向烧瓶中加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA; 0.5mL / 10cm ²培养表面积）将细胞胰蛋白酶化，并在37℃下孵育直至大部分细胞脱离。
3. 加入两卷培养基，并以180×g离心5分钟。去除上清液并将细胞沉淀重悬于5mL培养基中。通过22 G，½英寸针头过滤细胞以破坏细胞簇。
4. 将细胞以1:3的比例分裂成新的细胞培养瓶。孵育过夜后，取出未附着的PC12细胞。使附着的细胞保持进一步生长。
5. 重复此过程3次，以选择具有强粘附性的PC12的传代培养。用800μL/孔的大鼠尾部I型胶原（100μg/ mL）预涂6孔板。
6. 如步骤4.2所述对所选PC12细胞进行胰蛋白酶化，并通过a过滤22 G，½寸针打破细胞簇。用血细胞计数器计数细胞。在步骤4.5中在预涂布的6孔板中以10,000个细胞/孔的密度种细胞过夜，以使细胞附着于平板。
7. 用培养基（步骤4.1中所述）稀释游离NGF（10μg/ mL）和NGF HDL-模拟NP（10μg/ mL），以制备0.5,1,5,10,50和100ng / mL浓度。从每个孔中取出2 mL培养基，并用2 mL稀释的NGF或NGF HDL模拟NP替代。文化4天。
8. 在第4天，将培养基更换为含有相应治疗的新鲜培养基（如步骤4.1所述），并继续治疗3天。
9. 在第7天，用倒置的光学显微镜观察细胞，并以10X的放大倍数随机斑点图像。

NGF HDL模拟纳米颗粒的生物分布

1. 使用成年BALB / c小鼠（雄性，25-30g）至t估计NGF NPs的组织分布。随机将小鼠分成3组，每组3只。使用锥形塑料约束（ 例如，十倍体）来约束小鼠并用乙醇擦拭尾巴以促进血管舒张和静脉的可见性。
2. 通过尾静脉，以40μg/ kg的NGF剂量向每组小鼠（3组）注射100μL盐水，游离NGF或NGF HDL模拟NP。使用连接到1 mL注射器的30½G针。
3. 注射后30分钟，用3％吸入的异氟烷麻醉小鼠（氧气，流速为2L / min）。执行尾部和脚趾捏，以确定麻醉深度。通过心脏穿刺收集血液。
   1. 从心脏取出大约1毫升的血液。通过颈椎脱位安乐死每只老鼠。
4. 将小鼠胴体置于背侧卧位。使用手术剪刀打开腹部，将脂肪和肠子移开使用棉签将肝脏，脾脏和肾脏暴露出来。收获这些组织，并在1x PBS中冲洗干净血液。
5. 立即以3,400 xg和4℃离心血液样品5分钟，以获得血浆。将血浆和组织储存在-80°C直到分析。
6. 为了分析组织样品，将样品从-80℃移动到4℃，并将100毫克组织样品悬浮在10倍体积的提取缓冲液（0.05M乙酸钠，1.0M氯化钠，1％triton X-100， 1％BSA，0.2mM苯基甲磺酰氟和0.2mM苄索氯铵）。在10,000rpm和4℃均质5分钟。
7. 牺牲两只未处理的小鼠以收集空白血浆和组织，如步骤5.3和5.4所述。使用空白血浆或空白组织匀浆制备NGF标准溶液。
8. 如上所述，使用夹心ELISA试剂盒确定血浆和组织匀浆中NGF的浓度。

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结果

通过离子对策略制备的HDL模拟，α-生育酚包被的NGF NPs的工程方案如图1所示 。为了中和NGF的表面电荷，使用鱼精蛋白USP作为离子对试剂与NGF形成络合物。为了保护生物活性，原型HDL模拟NPs被设计，首先使用均质化;然后，NGF /鱼精蛋白复合物被封装到原型NPs中。均质化提供了足够的能量，并成功地促进了赋形剂的混合。均质3分钟后，样品NPs获得了一致的粒度（?...

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讨论

在本研究中，我们展示了制备用于NGF包封的HDL模拟NP的简单方法。已经研究了各种NP递送系统来递送蛋白质。目前，许多NP制剂涉及透析，溶剂沉淀和膜水合。这些过程在扩大规模时通常是复杂和具有挑战性的。在该NP开发中，确定了脂质对容器的玻璃壁具有很强的粘附性，这导致难以水合薄膜并有效地混合赋形剂。鉴于天然HDL NPs中的多种组分，混合变得非常具有挑战性，并且对于制备HDL模拟NPs至?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200